生化試劑分離試劑谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 H.P. C10H17N3O6S

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 H.P. C10H17N3O6S 

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠H.P.用于分離純化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽蛋白、其它來源的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶以及和谷胱甘肽具有親和作用的蛋白的親和層析介質(zhì)。pGEX載體表達(dá)的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合，因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。GSTs是一類以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作為底物，通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對底物的親和力是亞毫摩爾級的，可以用含游離谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白。
基質(zhì)：6%瓊脂糖凝膠
配基：肝素
顆粒大?。?5-165μm
大流速：600cm/h
工作pH：3-12
每毫升蛋白結(jié)合量：10mg 
操作溫度：室溫
保存條件：貯存于4°C-28°C（保存溶液為20%乙醇）

谷胱甘肽樹脂的處理:
1. 輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器，將樹脂混成勻漿。
2. 取部分勻漿放入15mL聚丙烯管（每100mL 細(xì)菌培養(yǎng)物大約需要2mL 勻漿）。
3. 4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清。
4. 在樹脂中加入10倍柱床體積預(yù)冷的PBS，顛倒數(shù)次混勻，4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清。
5. 每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數(shù)次，混合均勻，懸液冰上放置待用。
制備細(xì)胞抽提物：
1. 每100毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4mL PBS緩沖液中。
2. 加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。
3. 用針筒將10mL 濃度為0.2%的TritonX-100 強(qiáng)行注入黏稠的細(xì)胞裂解物中，劇烈振動(dòng)數(shù)次混勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL, 4℃振動(dòng)溫育10分鐘，4℃ 3000 g離心30分鐘，去除不溶性細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L。
純化融合蛋白
1.細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和，每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2mL樹脂，于室溫輕搖30min。
2. 混合物于4℃以500 g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
3. 沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻，洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白。
4. 4℃以500 g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5. 結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶、腸激酶或Xa 因子切割，釋放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：
1. 沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動(dòng)10min，洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白。
2. 4℃以500 g離心5分鐘，上清（含洗脫的融合蛋白）移至新管中。
3. 重復(fù)步驟5和6兩次，合并3次上清。蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：
4. 在結(jié)合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶、腸激酶或Xa 因子（根據(jù)融合蛋白中的位點(diǎn)選擇），每mL樹脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下振蕩2-16小時(shí)。
5. 4℃以500 g離心5分鐘，上清小心移至新管中。（GST仍結(jié)合在樹脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分離）
6. 10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成。試劑配制：谷胱甘肽洗脫緩沖液：10mmol/L還原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)