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HB190313
測(cè)序數(shù)據(jù)不好？是不是建庫出了問題？！
——從測(cè)序數(shù)據(jù)看文庫構(gòu)建
高通量測(cè)序中的文庫構(gòu)建指的是在DNA兩端連接特定的接頭從而使其符合測(cè)序平臺(tái)要求的過程，在高通量測(cè)序過程中，文庫質(zhì)量直接影響終測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，打個(gè)比方，如果文庫上機(jī)測(cè)序的濃度很低，樣本在FlowCell上擴(kuò)增所形成的DNA樣本簇就會(huì)很少，測(cè)序數(shù)據(jù)量也將減少，這就可能導(dǎo)致測(cè)序失敗，所以我們說文庫的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)估也是NGS中的關(guān)鍵步驟。
文庫如何質(zhì)控？
評(píng)估文庫質(zhì)量的方法有哪些？
n 文庫質(zhì)控：文庫在上機(jī)之前都有會(huì)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，質(zhì)量檢測(cè)合格的文庫才會(huì)上機(jī)測(cè)序。文庫上機(jī)之前的文庫質(zhì)控主要包括文庫片段大小和文庫濃度的質(zhì)控，具體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見往期推送：文庫質(zhì)檢方案的合理設(shè)計(jì)--文庫分布、文庫濃度、文庫質(zhì)量（超鏈接：h/t/t/ps://mp.weixin.qq.c/o/m/s/iM5eMweP1By6MoqrxOEBfw）。
n 文庫評(píng)估：文庫評(píng)估方法除了文庫大小和濃度之外，還包括文庫轉(zhuǎn)化率、文庫復(fù)雜度、均一性、準(zhǔn)確性和覆蓋度等。
1）文庫轉(zhuǎn)化率：是評(píng)估文庫質(zhì)量的重要指標(biāo)，它指的是文庫中兩端都連上接頭的目的片段占總片段數(shù)的比值，也代表測(cè)得產(chǎn)量與理論高產(chǎn)量之間的比值，這里的理論高產(chǎn)量考慮了PCR的擴(kuò)增效率問題及純化產(chǎn)生的損失。計(jì)算方法如下：
理論高產(chǎn)量=輸入量×（1+PCR擴(kuò)增效率）（PCR循環(huán)數(shù)）×（純化回收率）（clean up數(shù)）
為什么說文庫轉(zhuǎn)化率是重要指標(biāo)呢？這是因?yàn)橹挥须p端都連接上接頭的目的片段才能在FlowCell上面通過橋式擴(kuò)增形成簇，終完成測(cè)序過程，而不是雙端都連上接頭的目的片段終都不能完成測(cè)序過程，視為無效片段，如果這樣的片段過多直接影響終輸出數(shù)據(jù)的過少，甚至可能直接導(dǎo)致測(cè)序的失敗。
圖1.雙端帶接頭的DNA片段在Flowcell上擴(kuò)增圖
2）文庫復(fù)雜度：指的是文庫中DNA序列的復(fù)雜程度，一定的文庫復(fù)雜度對(duì)后期測(cè)序數(shù)據(jù)的分析尤為重要，復(fù)雜度高的文庫測(cè)序得到的數(shù)據(jù)重復(fù)讀數(shù)少，可以帶來更多有意義的信息，反之，低復(fù)雜度的文庫在信號(hào)讀取時(shí)往往產(chǎn)生簇信號(hào)混雜，易產(chǎn)生低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。
文庫復(fù)雜度與Input樣本質(zhì)量、文庫的轉(zhuǎn)化率、文庫擴(kuò)增時(shí)循環(huán)數(shù)有關(guān)。當(dāng)文庫的轉(zhuǎn)化率越高時(shí)，能從樣品種捕獲更多的特異分子，文庫復(fù)雜度就越高；當(dāng)輸入樣本量越低或文庫擴(kuò)增循環(huán)數(shù)越多時(shí)，文庫中不能帶來有意義信息的重復(fù)讀數(shù)就會(huì)增多，則文庫的復(fù)雜度越低。
表1.測(cè)序數(shù)據(jù)關(guān)鍵參數(shù)比較
Sample Input | Library Prep | Uniquely Mapped | Duplication Rate | Transcripts Detected | Genes Detected |
4 μg | A* | 69% | 31% | 111.370 | 20.547 |
B* | 76% | 24% | 112.136 | 21.016 | |
500 μg | A* | 64% | 36% | 109.810 | 20.134 |
B* | 71% | 29% | 110.690 | 20.644 |
3）均一性：指的是讀取數(shù)據(jù)在基因組或目標(biāo)區(qū)域的分布均一程度。其生信分析圖如圖2所示，一般認(rèn)為覆蓋越均勻，達(dá)到特定深度所需的測(cè)序數(shù)據(jù)就越少，覆蓋均一性的偏向通常是在文庫制備和文庫擴(kuò)增步驟中引入的，也就是說，覆蓋均一性很多時(shí)候取決于GC含量。
圖2.測(cè)序數(shù)據(jù)均一性
4）準(zhǔn)確性：
NGS文庫制備的準(zhǔn)確性越高，你對(duì)變異報(bào)告的信任程度就越高。核苷酸錯(cuò)誤通常在PCR擴(kuò)增以及測(cè)序過程中引入。測(cè)序錯(cuò)誤通常低于1%。通過使用高保真PCR試劑，可盡量減少文庫擴(kuò)增的錯(cuò)誤。NGS對(duì)照樣品也有助于評(píng)估NGS流程的準(zhǔn)確性。
圖3.PCR擴(kuò)增存在一定的錯(cuò)配率
5）測(cè)序深度和覆蓋度：
假設(shè)對(duì)長1000 bp的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲測(cè)序，每個(gè)read長10 bp，總共得到3000個(gè)reads，把所有的reads對(duì)比到目標(biāo)區(qū)域后，1000 bp的目標(biāo)區(qū)域中有990 bp的位置至少有1個(gè)read覆蓋到，換言之剩余的10bp沒有1個(gè)read覆蓋。
則此時(shí)：
測(cè)序深度（depth）3000*10/1000=30 也就是說測(cè)序深度為30*
覆蓋度（coverage）990/1000*100%=99% 這次測(cè)序覆蓋度為99%
同理：
假設(shè)對(duì)長100bp的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲測(cè)序，每個(gè)read長5bp，總共得到200個(gè)reads，把所有的reads對(duì)比到目標(biāo)區(qū)域后，100bp的目標(biāo)區(qū)域中有98bp的位置至少有1個(gè)read覆蓋到，換言之剩余的2bp沒有1個(gè)read覆蓋。
深度（depth）200*5/1000=10 也就是說測(cè)序深度為 10*
覆蓋度（coverage）98/100*100%=98% 這次測(cè)序覆蓋度為98%
文庫構(gòu)建中的哪些步驟會(huì)直接影響測(cè)序質(zhì)量？
NGS的終目的就是得到測(cè)序數(shù)據(jù)助力于下游科學(xué)研究或?qū)嶋H應(yīng)用，其中文庫構(gòu)建是測(cè)序數(shù)據(jù)的重要影響因素，文庫構(gòu)建一般包括以下幾類步驟（以DNA為例）：樣本片段化、接頭連接、分選/純化、文庫擴(kuò)增。文庫對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的影響，具體到文庫構(gòu)建的每個(gè)步驟，參考表2。
表2.建庫步驟對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響
步驟 | 評(píng)估指標(biāo) | 對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響 |
樣本片段化 | 打斷隨機(jī)性 | 文庫質(zhì)量；測(cè)序數(shù)據(jù)的均一性和覆蓋度 |
片段大小是否集中 | 文庫濃度；測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋度 | |
接頭連接 | 接頭連接效率 | 文庫轉(zhuǎn)化率；文庫復(fù)雜度；均一性；準(zhǔn)確性和覆蓋度 |
分選/純化 | 片段大小的一致性 | 片段大小與測(cè)序儀大小不匹配將無法上機(jī)測(cè)序 |
回收效率 | 文庫濃度；測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋度 | |
文庫擴(kuò)增 | 擴(kuò)增偏好性 | 文庫復(fù)雜度；均一性 |
擴(kuò)增效率 | 文庫濃度；文庫復(fù)雜度 |
