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實(shí)驗(yàn)室常用到的實(shí)驗(yàn)：逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)體外模擬病毒復(fù)制過(guò)程，以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄酶催化，合成出與RNA互補(bǔ)的cDNA鏈。終構(gòu)建cDNA文庫(kù)，并從中篩選所需的靶標(biāo)基因。
BUT！小伙伴們做逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)，
1）有沒(méi)有深究過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA能不能真實(shí)反映出基因表達(dá)信息？
2）做實(shí)驗(yàn)時(shí)，有沒(méi)有發(fā)生過(guò)內(nèi)參做的很好，目的基因做不出的情況？
如果有發(fā)生上述情況，那么需要重新評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。
逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果有效性的評(píng)定
逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性的評(píng)定重要的是盡可能反映樣本中原始RNA模板的信息，即均一性地將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。理論上來(lái)講，不考慮堿基組成的影響，均一性體現(xiàn)在不同位置處的片段同等效率地合成cDNA，進(jìn)而保證真實(shí)地反映轉(zhuǎn)錄譜中不同基因的實(shí)際豐度。
逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的成功與RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物及反應(yīng)程序等有關(guān)。當(dāng)我們實(shí)驗(yàn)做不成功時(shí)，大家會(huì)優(yōu)先從模板、逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)找原因，往往忽略引物在其中起的作用，其實(shí)引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄成敗也至關(guān)重要。
今天小翊就跟大家討論下逆轉(zhuǎn)錄引物的分類和選擇。
逆轉(zhuǎn)引物的分類和選擇
逆轉(zhuǎn)錄引物有三類，Oligo dT引物、隨機(jī)引物、基因特異性引物（GSP，Gene Specific Primer）。
1）Oligo dT引物：
若干dTTP組成的引物，可以和真核生物mRNA的Poly A尾配對(duì)，與模板結(jié)合特異性高。因該特異性，常適用于獲取轉(zhuǎn)錄本靠近3’末端序列。它不適用于降解的RNA模板，也不適用于缺少A尾的RNA，如原核生物RNA和miRNA。當(dāng)RNA模板降解時(shí)或RNA內(nèi)部中有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)造成cDNA合成長(zhǎng)度變短，無(wú)法有效合成靠近RNA 模板5’末端的序列。這是影響均一性的常見(jiàn)因素。
也常見(jiàn)Oligo dT序列的3’端存在幾個(gè)錨定堿基，如常見(jiàn)的miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄引物。
2）隨機(jī)引物
隨機(jī)引物是若干個(gè)堿基組成的寡核苷酸，如隨機(jī)六聚體，5’-d（NNNNNN）-3’，是各種引物的混合物。它與模板結(jié)合的特異性低，可在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短的、部分長(zhǎng)度的cDNA。常適用于獲取轉(zhuǎn)錄本5’末端序列及二級(jí)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的區(qū)域。一般不建議用于長(zhǎng)片段序列的合成。有文獻(xiàn)報(bào)道15個(gè)堿基的隨機(jī)引物比6堿基和9堿基隨機(jī)引物轉(zhuǎn)錄出的cDNA產(chǎn)量和基因豐度更高[1]
3）基因特異性引物（GSP）
基因特異性引物（GSP）也即是反向引物，是與模板序列互補(bǔ)的引物，需要實(shí)驗(yàn)者根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自己設(shè)計(jì)合成，適用于目的序列已知的情況。若做一步法RT-PCR，只能用GSP引物。設(shè)計(jì)GSP的原則同PCR引物相同。
若研究真核基因時(shí)，可將Oligo dT與隨機(jī)引物混合使用，集二者之長(zhǎng)，得到的cDNA均一性更好。實(shí)驗(yàn)重復(fù)性也更高。
對(duì)三種引物有初步了解后，針對(duì)一些實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題，小翊給大家提供了實(shí)驗(yàn)建議。
實(shí)驗(yàn)建議
問(wèn)題一：大鼠肝臟的RT-qPCR，逆轉(zhuǎn)錄用的是oligo dT引物，PCR時(shí)內(nèi)參出的很好，就是目的基因不出，已經(jīng)差不多一個(gè)月了。怎么辦？
小翊建議：根據(jù)Oligo dT引物介紹，具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA也會(huì)破壞全長(zhǎng)cDNA的合成，造成RNA 5’末端的代表性下降。同樣的，RNA模板出現(xiàn)降解時(shí)，也會(huì)造成Oligo dT全長(zhǎng)cDNA合成能力的下降。建議使用Oligo dT/隨機(jī)引物的混合物作為逆轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)引物。
問(wèn)題二：RNA模板有降解怎么辦？
小翊建議：盡量選用RNA質(zhì)量好的樣本，但是如果條件不允許，建議用隨機(jī)引物，適合poly A比較短或被降解的情況做逆轉(zhuǎn)錄。
問(wèn)題三：RNA病毒研究用什么引物？
小翊建議：在ＲＮＡ病毒的研究中一般用隨機(jī)引物和基因特異性引物。一方面是病毒RNA沒(méi)有ＰolyＡ的原因。另一方面，當(dāng)復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)較多時(shí)，使用基因特異性引物有利于提高退火溫度，打開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，合成較長(zhǎng)的cDNA片段。
好啦,逆轉(zhuǎn)錄引物的介紹就到這里啦,期望對(duì)小伙伴的實(shí)驗(yàn)有所幫助。
參考文獻(xiàn)
[1] Stangegaard M1, Dufva IH, Dufva M.Reverse transcription using random pentadecamer primers increases yield and quality of resulting cDNA[J].Biotechniques,2006 May,40(5):649-57.
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