磁珠是高通量測序過程*產品，通過磁顆?；钚曰鶊F在一定條件下可與核酸結合和解離的原理，將樣本中目的片段分離。可實現對核酸樣本的高通量自動化操作，廣泛應用于基因測序以及分子診斷領域。

背景篇

磁珠的發(fā)明構想初來自于挪威科技大學的化學家John Ugelstad，他在1976年以聚苯乙烯為主要材料，制作出均勻磁化的球體粒子。1979年Vogelstein等報道在高濃度典化鈉存在的條件下，玻璃粉末作為吸附劑用于從瓊脂糖凝膠中提取DNA片段，而后基于硅膠和其他具有親水性表面載體的固相核酸純化技術廣泛發(fā)展起來。而基于磁性微粒的核酸純化方法就是其中的一種。

結構篇

雖然到目前為止納米級別的磁珠各式各樣，表面性質不同，分離的原理也不盡相同，但其材料組成和基本的結構并無太大的差異?；A結構分為三層，內層的是聚苯乙烯，第二層包裹磁性物質（通常是Fe₃O₄），外層是修飾的官能團（如羧基）。其中官能團能與核酸結合，表面基團不同，下游的應用也不盡相同，如核酸提取，純化，生物素捕獲等。

圖 磁珠結構示意圖

原理篇

商業(yè)化磁珠產品體系一般包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、鹽離子等。基于SPRI(Solid Phase Reversible Immobilization )技術， DNA在一定濃度的PEG存在條件下，NaCl或MgCl₂促進條件下，DNA分子構象會發(fā)生急劇變化，會暴露出磷酸骨架上大量的帶負電荷的磷酸基團，與表面帶負電荷的羧基磁珠結合。目前認為這種負負電荷間的作用是由于帶正電荷的鹽離子的作用（如Na⁺）。帶負電磷酸基團借由解離的鹽離子（如Na⁺）與羧基形成離子橋，使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面。利用磁珠的磁性，可通過外加磁場進行收集洗脫。

圖 磁珠吸附DNA原理示意圖

操作篇

受益于高通量測序技術的發(fā)展，磁珠也憑借其高通量，適用于自動化的特點備受推崇，廣泛用于NGS文庫構建中DNA純化/雙輪分選（片篩）。

DNA純化的目的在于去除不想要的片段，由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，因而可通過一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丟棄上清（去除非目標片段）后將磁珠吸附的DNA洗脫回收。常用于小片段如接頭二聚體/引物二聚體的去除。

圖 DNA純化操作示意圖

DNA雙輪分選（片篩）目的在于從片段化DNA中選擇特定區(qū)域的DNA片段大小。由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，因而需通過兩輪磁珠操作進行分選。以分選450-550 bp的片段范圍為例：首先輪磁珠吸附550 bp以上片段，此時棄磁珠留上清，則上清中片段為550 bp以下的片段。第二輪取磁珠吸附450 bp以上（550 bp以下）磁珠，此時棄上清，再將磁珠上的目的片段洗脫回收。常用于NGS文庫構建片段分選（片篩）。

圖 DNA雙輪分選操作示意圖

結果分析篇

1. 磁珠回收效率

   DNA樣本經磁珠純化后會有部分樣本的損失，磁珠回收效率可評估磁珠的回收能力。具體可通過計算得出：回收效率=（純化后的DNA質量/Input DNA質量）×100%。

   以下表為例，相同的比例條件下：測試人1測試A樣本回收效率=153.25/169.5=90.41%，同理可計算其他樣本的回收效率。

表 磁珠回收效率計算

【注】：磁珠測試數據來源于上海某生物公司, 表格中A為AMPure XP磁珠；B、C、D分別是翊圣磁珠三個不同批次。

2. 磁珠分選精度

   由于二代測序段短讀長的局限性，因而終的NGS文庫需滿足一定的長度要求。因而NGS建庫中可能會分選特定長度區(qū)間的片段，滿足上機需求。分選精度則是評估不同的磁珠投入比例分選得到的片段大小。一般以Agilent 2100儀器檢測。

   在特定磁珠比例（0.45×/0.15×）條件下，不同樣本分選后片段分布范圍集中在同一位置。較好的分選效果圖應該是頂部窄而圓潤的獨峰。

【注】：數據結果來源于上海某生物公司。值得注意的是：不同廠家磁珠buffer的不同，導致相同比例條件下分選得到的片段范圍也不一致，使用前請按照對應的磁珠說明書選擇合適的分選比例進行操作。

注意事項篇

1. 磁珠使用前需平衡至室溫，否則影響實驗效果（PEG分離效果易受pH、溫度等影響）；

2. 用于磁珠洗脫的80%無水乙醇需現用現配；

3. 長度分選時建議初始體積≥100 μL，不足時請用超純水補齊（樣品體積太小，將導致移液誤差增大，進而影響分選的準確性）；

4. 磁珠分選時特別注意輪分選后棄含大片段的磁珠，第二輪棄含小片段的上清；

5. 輪分選轉移上清時，避免吸到磁珠，引起大片段殘留；

6. 分選/純化產物如需長時間存放請用TE buffer洗脫保存。

FAQ篇

看起來很簡單的純化/分選實驗，卻在實際實驗中有各種意外的情況。那關于產品選擇以及使用方面我們實際操作中有什么需要注意的事項呢？

產品應用：

1. 磁珠可以吸附ssDNA嗎？

A：可以回收單鏈DNA，具體性能沒有測試過。附圖是Beckman磁珠回收單鏈DNA的數據，可以作為參考。

2. 分選磁珠可以純化gDNA嗎？

A:翊圣分選磁珠測試過大20kb的片段，回收率>90%?；蚪M DNA 未測試過，測試時，由于大DNA與磁珠結合的非常緊，建議盡量增加洗脫液體積，避免干燥時間過久。

3. 磁珠的DNA結合能力怎么樣？

A：在目前的磁珠體系中，磁珠的吸附能力均為過飽和，客戶不必擔心磁珠結合能力不足的情況。根據已知的報道，每1 μL磁珠可以結合7 μg DNA。

4. 使用磁珠吸附小片段的時候，大片段也會吸附上來嗎？

A: 磁珠優(yōu)先吸附大片段，增大磁珠投入量時，磁珠會在吸附大片段的基礎上增強吸附小片段的能力。舉例說明：

參考磁珠純化分選表，100 μL樣本，加入80 μL磁珠Cat#12601,此時磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是，當磁珠投入量至100 μL時，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。

產品使用效果：

1. 使用磁珠分選/純化之后，還有小片段殘留是怎么回事？

A: 小片段殘留大部分是接頭二聚體/引物二聚體。若純化，降低磁珠比例；若分選：可適當降低二輪磁珠比例可有效改善此類情況。

2. 磁珠回收率低可能的原因是什么？

A：1）磁珠與DNA混勻不充分，未能充分吸附。建議反應體系充分混勻；

2）磁珠比例不對，建議按照說明書進行選擇合適的比例；

3）孵育時間不足，保證孵育時間至少5 min；

4）磁珠分選時，二輪磁珠吸附的時候吸到磁珠。可在200 μL 槍頭前串聯 10μL槍頭用于移液，可防止吸到磁珠；

5）磁珠洗滌時的乙醇非現配，導致乙醇濃度過低，建議乙醇濃度不低于70%；

6）干燥過度：磁珠長時間干燥導致表面龜裂，DNA難以洗脫，得率降低；建議干燥時間不宜過長，表面剛出現龜裂即可；

7）洗脫液體積不足：終洗脫液應*覆蓋管內磁珠。

產品儲存：

1. 磁珠不小心放在低溫（-20℃）凍了一段時間，還能用嗎？

A：不能使用，低溫會破壞磁珠表面集團的修飾，影響磁珠回收性能。

關于我們

翊圣生物是專注于分子酶原料創(chuàng)新研發(fā)的高新技術企業(yè)。而磁珠是NGS文庫構建*產品。根據市場磁珠需求，YEASEN集中專業(yè)人員，致力于磁珠系列產品的創(chuàng)新開發(fā)，目前已經擁有多款核酸純化類磁珠產品，可應用于高通量測序與核酸純化。

圖 翊圣磁珠系列產品

磁珠產品選擇指南

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