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你是否正在驗(yàn)證miRNA與lncRNA的作用機(jī)制？
是否在分析確認(rèn)miRNA的靶基因？
在研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)中，你是否想確定結(jié)合位點(diǎn)的序列？
這些問題都可以用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)嘗試解決。
雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)介紹
基于熒光素酶（luciferase）的發(fā)光原理，科學(xué)家發(fā)明了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。兩者可催化各自的底物發(fā)生氧化作用產(chǎn)生生物熒光，產(chǎn)生的熒光數(shù)值大小即表示了兩種酶的表達(dá)量多少。
圖1. Luciferase發(fā)光原理
Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被稱為報(bào)告基因，是因?yàn)樵诨虮磉_(dá)調(diào)控研究時(shí)，利用兩者表達(dá)產(chǎn)生的熒光比值可以監(jiān)控、證實(shí)微觀層面上的分子間的相互作用。具體做法是：將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動(dòng)子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的作用或miRNA對(duì)目的基因或lncRNA的調(diào)控作用（見圖2）。與此同時(shí)，引入包含Renilla luciferase基因的TK載體作為內(nèi)參，以便消除細(xì)胞轉(zhuǎn)染等因素帶來(lái)的組間誤差。
圖2.報(bào)告基因系統(tǒng)用于基因表達(dá)調(diào)控研究
雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)中的luciferase來(lái)源于細(xì)菌、螢火蟲、發(fā)光海洋生物等，可以在哺乳細(xì)胞中直接表達(dá)，無(wú)需表達(dá)后修飾，直接具備*酶活性。與綠色熒光蛋白（GFP）不同，它們的發(fā)光檢測(cè)不需要激發(fā)光激發(fā)，且發(fā)光穿透力更強(qiáng)，這使其具備可定量、高靈敏度及低背景等特點(diǎn)。
雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的應(yīng)用
下面從實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析幾個(gè)方面介紹幾個(gè)案例，供大家參考。
1、利用雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)研究miRNA與3’UTR的相互作用
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>：驗(yàn)證大鼠miR-1與靶基因ATG13 3’UTR是否發(fā)生作用，并進(jìn)一步確定miR-1與ATG13 3’UTR的作用位點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建luc-3’-UTR-WT載體和luc-3’-UTR-mut載體，將其與海腎載體及miRNA mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24-48h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（翊圣產(chǎn)品貨號(hào)：11402ES）檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)分組：
a | Luc-NC + mimics-NC |
b | Luc-NC + mimics-miR-1 |
c | Luc-3’UTR-WT + mimics-NC |
d | Luc-3’UTR-WT + mimics-miR-1 |
e | Luc-3’UTR-mut + mimics-NC |
f | Luc-3’UTR-mut + mimics-miR-1 |
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
實(shí)驗(yàn)分組 | Luc值（均值） | Ren值（均值） | Ratio (均值) |
Luc-NC + mimics-NC | 185214 | 32007 | 5.798 |
Luc-NC + mimics-miR-1 | 174577 | 30016 | 5.854 |
Luc-3’UTR-WT + mimics-NC | 186580 | 32249 | 5.820 |
Luc-3’UTR-WT + mimics-miR-1 | 35773 | 30233 | 1.202 |
Luc-3’UTR-mut + mimics-NC | 186556 | 32489 | 5.757 |
Luc-3’UTR-mut + mimics-miR-1 | 188393 | 32550 | 5.821 |
圖3. miR-1與3’UTR相互作用的分析（***表示p<0.001）
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
ATG13 3’UTR為miR-1靶序列。
- 利用雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的相互作用
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模候?yàn)證轉(zhuǎn)錄因子IRF3對(duì)IFN-β啟動(dòng)子的調(diào)控作用。
實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建Luc-IFN-β啟動(dòng)子載體和IRF3的過表達(dá)載體。共轉(zhuǎn)染后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（翊圣產(chǎn)品貨號(hào)：11402ES）檢測(cè)分析熒光值差異。
實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組為Luc-IFN-β和pTK-RL，實(shí)驗(yàn)組為L(zhǎng)uc-IFN-β、pTK-RL和IRF3的過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
實(shí)驗(yàn)分組 | Luc值（均值） | Ren值（均值） | Ratio (均值) |
對(duì)照組 | 69576 | 456979 | 0.15 |
實(shí)驗(yàn)組 | 462790 | 16248 | 28.48 |
圖4. IRF3對(duì)IFN-β啟動(dòng)子的調(diào)控
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子IRF3對(duì)IFN-β啟動(dòng)子起正調(diào)控作用。
影響雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的因素
作為報(bào)告基因檢測(cè)試劑研發(fā)的廠家，我們?yōu)榇蠹铱偨Y(jié)了獲取好數(shù)據(jù)的方法，避免大家掉坑：
坑1：檢測(cè)數(shù)值太低
正常表達(dá)水平下，熒光值的數(shù)量級(jí)應(yīng)在104-107數(shù)量級(jí)左右，導(dǎo)致數(shù)值低主要有以下幾個(gè)原因：?jiǎn)?dòng)子活性、轉(zhuǎn)染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不規(guī)范等原因，具體的原因需要實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行排查。相應(yīng)的解決方案如下表：
實(shí)驗(yàn)問題 | 解決方案 |
轉(zhuǎn)染效率低 | 1、確保細(xì)胞狀態(tài)是良好的，通常選擇指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染； 2、可以選擇過表達(dá)的熒光蛋白質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照； 3、轉(zhuǎn)染試劑的選擇也至關(guān)重要，比如在做miRNA研究的實(shí)驗(yàn)中，如果Lipo2000或Lipo3000的轉(zhuǎn)染效率不能滿足的話，可以選擇更換其它轉(zhuǎn)染試劑。 |
裂解不充分
| 1、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，不超過36h，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)的話，細(xì)胞難裂解 2、裂解液的量要足以充分裂解細(xì)胞 3、實(shí)驗(yàn)對(duì)象為煙草葉片時(shí)，可在EP管中加入液氮和預(yù)冷的小鋼珠對(duì)葉片進(jìn)行研磨，使裂解更充分 |
底物失效
| 1、底物保存的時(shí)候要避光低溫保存，尤其是腔腸素，推薦-80℃保存。 2、反應(yīng)工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用。 |
操作不當(dāng) | 熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測(cè)，盡量在30min內(nèi)完成。 |
坑2. 復(fù)孔差異大
雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)較為靈敏，檢測(cè)結(jié)果受多種因素的影響，因此，一般設(shè)置3個(gè)或3個(gè)以上的復(fù)孔，復(fù)孔之間有差異是正常的，差異在同一個(gè)數(shù)量級(jí)可以接受。想要得到更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需盡量減少?gòu)?fù)孔的差異性，建議如下：1、裂解后建議離心取上清，保證樣本均一性；2、保證加樣的準(zhǔn)確性；3、樣品和底物混合后到檢測(cè)前的時(shí)間以及檢測(cè)時(shí)間應(yīng)控制在相同的時(shí)間內(nèi)。
以上的實(shí)驗(yàn)方案和建議是否對(duì)您有幫助呢？如有不解歡迎咨詢小翊。祝大家實(shí)驗(yàn)順利~
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