背景介紹

熒光素酶生物檢測技術(shù)誕生于1990年，已有供了更可靠的研究30年的發(fā)展史。單熒光素酶檢測系統(tǒng)到雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炇侄?。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在原有的基礎(chǔ)上引入了海腎報告基因，可以排除不同組之間細(xì)胞生長狀況、細(xì)胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結(jié)果更為可靠。其發(fā)光原理如下圖1。

圖1 雙熒光素酶發(fā)光原理

實驗方案

將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調(diào)控作用。如圖2.

圖2 報告基因系統(tǒng)用于基因表達調(diào)控研究

實驗應(yīng)用

1）啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄因子的研究；

2 ) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究；

3）蛋白質(zhì)相互作用；

4）miRNA、LncRNA、siRNA等的研究。

。。。

雙報告基因檢測試劑盒多用于動物細(xì)胞中，也有相關(guān)科研人員以植物為研究對象。不同的研究對象其操作流程有一定的差異。這里為大家提供細(xì)胞、煙草葉片和原生質(zhì)體這三種研究對象對應(yīng)的操作流程：

一、細(xì)胞篇

1、制備重組質(zhì)粒

2、共轉(zhuǎn)染：將Luc/Ren載體和目的基因進行共轉(zhuǎn)染，通常24-48h(選擇轉(zhuǎn)染效率較高的細(xì)胞如293T)，載體的轉(zhuǎn)染比例要進行摸索（如1:10、1:20、1:50、1:100），原則上海腎熒光素酶讀值不蓋過主報告基因讀值為好。具體的轉(zhuǎn)染流程參照相關(guān)說明書；

3、細(xì)胞裂解處理

a: 對于貼壁細(xì)胞，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液，按照下表比例加入細(xì)胞裂解液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂

解液*覆蓋細(xì)胞；

b: 對于懸浮細(xì)胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液；

冰上孵育5min，充分裂解細(xì)胞。10000-16000rpm離心1min，取上清；

4、熒光檢測（使用含有生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光模塊的酶標(biāo)儀）

取20 μL細(xì)胞裂解液，加至黑色酶標(biāo)板中。加入100 μL 1×螢火蟲熒光素酶反應(yīng)液，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力; 加入100 μL 1×海腎熒光素酶反應(yīng)液，檢測海腎熒光素酶的活力。兩個反應(yīng)都在30min完成。

5、數(shù)據(jù)分析：實驗結(jié)果為Luc值與Ren值之比。

二、煙草葉片篇

1、制備重組質(zhì)粒

2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化比例需要摸索。轉(zhuǎn)化后需過夜培養(yǎng)，OD600達到0.8以上即可；

3、利用無針頭注射器注射葉片，（先用針頭在葉片上扎個小孔）（注射煙草頂端以下第3-5片葉片）；

4、暗培養(yǎng)1d，光照培養(yǎng)2d;

5、取葉片進行打孔，8mm-1.5cm即可;

6、在2mL的EP管中加入預(yù)冷的小鋼珠，放入3-4片煙草葉盤并加入適量的液氮，使用儀器進行研磨破碎（45Hz，30s），加入100μL裂解液，10000-16000rpm離心2min，取上清20μL進行檢測。

7、檢測：方法同動物細(xì)胞。

三、原生質(zhì)體篇

1、原生質(zhì)體的制備：不同植物原生質(zhì)體的分離略有差異，請參考相關(guān)文獻；

2、原生質(zhì)體的計數(shù)與活力測定：取少量原生質(zhì)體稀釋液滴加在0.1mm的血球計數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)。用0.01% FDA進行染色，在顯微鏡下對發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體進行計數(shù)。計算原生質(zhì)體的活力。

3、構(gòu)建重組載體；

4、PEG-Ca²⁺介導(dǎo)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：用MMG溶液重懸原生質(zhì)體。在1.5mL EP管中加入Luc、Ren載體（比例需摸索）、100μL 原生質(zhì)體和110μL PEG4000-Ca²⁺溶液，黑暗處放置20min，加入W5終止反應(yīng)，離心棄上清，用1mL W1溶液重懸原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)板中，25℃靜置培養(yǎng)20h；

5、原生質(zhì)體的裂解：將原生質(zhì)體加入2mL離心管中，離心收集原生質(zhì)體，加入100μL左右的裂解液，冰上孵育10min左右。10000-16000rpm離心5min。

6、檢測：取20μL上清至1.5mL EP管中，檢測方法同動物細(xì)胞。

FAQ

Q1: 如何選擇海腎報告基因質(zhì)粒？

A1: 盡量選擇中等強度的啟動子，如TK啟動子等，不要選擇強啟動子CMV、SV40等。海腎基因的表達活性應(yīng)顯著高于背景組，同時不干擾螢火蟲熒光素酶報告基因的表達。

Q2: 如何選擇螢火蟲報告基因質(zhì)粒？

A2：原則上含有l(wèi)uc基因就可以，但是不同實驗所需的載體有一定差異，如研究miRNA、轉(zhuǎn)錄因子的載體是不同的。小翊為大家提供了多種研究轉(zhuǎn)錄因子活性的報告基因載體，可以直接使用，如果您要自己構(gòu)建載體，要注意有些載體沒有啟動子，需要自行插入啟動子，如pGL3 Basic。

Q3: psiCHECK-2的主報告基因是海腎報告基因，而不是螢火蟲報告基因，能用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗嗎？

A2：該質(zhì)?？梢杂糜陔p熒光素酶報告基因檢測實驗，本試劑盒的檢測原理是酶和底物的反應(yīng)，兩種酶經(jīng)裂解處理后都會釋放出來，所以使用該質(zhì)粒不影響檢測實驗。后的數(shù)值為Ren值與Luc值之比。

Q4: 檢測體系可以自行調(diào)整嗎？
A4: 我們推薦20μL裂解液，100μL螢火蟲熒光素酶底物，100μL海腎熒光素酶底物。底物的量可以適當(dāng)調(diào)整，但是要保證底物是足量的。

Q5: 數(shù)值低，什么原因造成的？

A5: 可能是啟動子活性、轉(zhuǎn)染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不規(guī)范等原因造成的，具體的原因需要實驗者進行排查。

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