TUNEL法檢測細胞凋亡常見問題及解決方案

大家好，我是你們的實驗小助手小翊，上一期我們講到了細胞凋亡檢測的各種手段。這一期我們介紹其中的一種細胞凋亡檢測方法--TUNEL法，重點分析TUNEL檢測細胞凋亡常見問題及解決方案。首先要先了解一下TUNEL染色步驟，如下圖所示。

圖1 TUNEL染色操作步驟（注：細胞核染色步驟可選）

用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡過程中，需要用到蛋白酶K、熒光素-dUTP、TdT酶等各種試劑，除此以外，還要設(shè)置陽性和陰性對照組，面對試劑盒各組分的作用以及繁瑣的操作步驟，許多人表示疑惑，下面我們就一一解答。

1. TUNEL試劑盒主要成分及功能

1）Equilibration緩沖液：用于維持一定的反應(yīng)條件，緩沖液中的Mg²⁺降低背景，Mn²⁺增強染色效果。

2）蛋白酶K（Proteinase K）：通透細胞膜和核膜，保證TUNEL探針進入細胞中，保證染色充分。

3）熒光素-dUTP：標(biāo)記3'-OH末端和作為TdT酶的底物。

4）TdT酶：催化dUTP標(biāo)記3'-OH末端的關(guān)鍵酶。

2 .陽性組、陰性組、實驗組

1）陽性組：用DNase酶處理，誘導(dǎo)細胞凋亡、暴露出3^，-OH末端。每次實驗做一個即可。

2）陰性組：不加TdT酶，其余操作和實驗組相同。每種切片樣本各需要做一個陰性對照。比如有5個老鼠的肺組織切片樣本，那么就需要做5個陰性組。

3）實驗組：除了陽性組和陰性組，所有的樣本均是實驗組。

3.為什么設(shè)置陽性組、陰性組

1）陽性組：用來驗證本次實驗操作和試劑盒有無問題。

2）陰性組：a.排除細胞自身凋亡以及操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?/span>；b.調(diào)整拍攝曝光強度。

除此以外，大家或多或少會遇到染色結(jié)果異常，包括熒光信號弱、沒有熒光信號、假陽性高、熒光背景強等問題。染色失敗的原因主要包括樣本處理不當(dāng)、染色不充分、曝光時間過長等，可從以下幾個方面對癥分析。

4. 熒光信號弱或沒有熒光信號

若已知細胞或者組織樣本處于細胞凋亡狀態(tài)，但是用TUNEL試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)熒光信號偏弱或沒有信號。

4.1樣本處理不當(dāng)

1）樣本切片太厚。建議適當(dāng)將切片切薄一點，便于染色。

2）脫蠟和水化不充分。建議脫蠟先60 ºC 20 min，再使用二甲苯兩次5-10 min；而水化用梯度乙醇從高到低濃度浸洗。

3）Proteinase K的孵育時間過短。優(yōu)化Proteinase K的孵育時間，常用時間10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。

4）Proteinase K濃度過低。建議蛋白酶K一般工作液濃度為20 μg/mL。

5）放置在-20 ºC保存較長時間的切片不新鮮，減低染色效率。建議使用新鮮切片。

4.2染色操作不當(dāng)

6）染色時間過短。建議一般 37 ºC 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長至2 h，但要結(jié)合背景著色。

7）TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過低。建議適當(dāng)提高TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度。

8）TdT酶失活。建議TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導(dǎo)致TdT酶失活。

9）樣本干燥。加上TUNEL反應(yīng)液后，請蓋上蓋玻片/保鮮膜/濕盒中進行，保證樣本均勻染色，又可防止反應(yīng)液干燥。

4.3熒光檢測操作不當(dāng)

10）操作未避光。由于熒光易碎滅，建議標(biāo)記與檢測樣本時，載玻片要避光，觀察時要盡量快。

5.非特異性染色（假陽性高）

若已知細胞或者組織樣本依然處于活細胞狀態(tài)，但是用TUNEL試劑盒檢測，出現(xiàn)了非特異性染色，和處理過的熒光信號一樣強，甚至比陽性對照組熒光信號還要強。

5.1樣本處理不當(dāng)

1）使用酸性或堿性固定液，導(dǎo)致DNA損傷。建議使用pH中性的固定液固定組織或者細胞。

2）固定液濃度過高，導(dǎo)致細胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。

3）固定時間過長，導(dǎo)致細胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議控制固定時間在4 ℃放置25 min。

4）蛋白酶K處理時間過長，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)縮短處理時間。

5）蛋白酶K濃度過大，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)調(diào)整蛋白酶 K溶液濃度，一般工作液濃度為20 μg/mL。

5.2 染色操作不當(dāng)

6）TUNEL染色時間過長。建議一般是 37 ºC 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長至2 h，但要結(jié)合背景著色。

7）未充分清洗樣本。染色后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片的非特異性染色。

6.熒光背景強

6.1染色操作不當(dāng)

1）TUNEL染色時間過長。建議染色時間適當(dāng)，一般是 37 ºC 孵育60 min，避免串色。

2）TUNEL染色液濃度過大。建議增大稀釋倍數(shù)，優(yōu)化濃度。

3) 使用試劑盒提供的二價陽離子優(yōu)化反應(yīng)，試劑盒中的Mg²⁺可降低背景，Mn²⁺可增強染色效果。

4）PBS未充分清洗樣本。在TUNEL反應(yīng)后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片樣本中殘留的染料。

6.2熒光檢測操作不當(dāng)

5）曝光時間過長。建議調(diào)整曝光條件，先對陰性組調(diào)整到無背景光，然后用這個曝光條件去拍攝實驗組（可以微調(diào)，但是不需要大調(diào)）。

以上就是小翊為大家整理的TUNEL實驗中可能遇到的問題及相應(yīng)的建議，希望對大家有所幫助，同時也歡迎大家積極留言補充，小翊會耐心為您解答。

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