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PCR-Free建庫(kù)，你get到了嗎？
高通量測(cè)序中，常規(guī)的文庫(kù)構(gòu)建需要PCR擴(kuò)增，一方面，是為了對(duì)微量DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，提高文庫(kù)產(chǎn)量，另一方面，可以放大熒光信號(hào)，讓測(cè)序儀更容易捕獲和識(shí)別熒光信號(hào)，提高測(cè)序準(zhǔn)確度。但是，PCR就像一把“劍"，在解決了樣本起始量低的問(wèn)題并起到放大熒光信號(hào)作用的同時(shí)，卻也引入了擴(kuò)增錯(cuò)誤和偏向性，不能地呈現(xiàn)基因組序列“真實(shí)面貌"。因此，PCR-Free技術(shù)的引入，既具備了PCR的優(yōu)勢(shì)，也克服了PCR的缺點(diǎn)。
什么是PCR-Free技術(shù)？
常規(guī)NGS文庫(kù)構(gòu)建的核心步驟為：基因組打斷-末端修復(fù)-加接頭-PCR-測(cè)序前信號(hào)放大。那么，PCR-Free建庫(kù)又是怎樣的呢？顧名思義，就是不需要PCR的建庫(kù)過(guò)程。其文庫(kù)構(gòu)建的核心步驟為：基因組打斷-末端修飾-加接頭-文庫(kù)質(zhì)控。但事實(shí)上，這只能算是建庫(kù)環(huán)節(jié)的PCR-Free。真正的PCR-Free，應(yīng)該是從建庫(kù)到測(cè)序全流程均無(wú)文庫(kù)擴(kuò)增的過(guò)程（例如單分子測(cè)序技術(shù)）或者無(wú)PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤累積的測(cè)序技術(shù)（例如MGI的DNBseq）。
圖1：常規(guī)建庫(kù)與PCR-Free建庫(kù)流程圖
PCR-Free技術(shù)優(yōu)勢(shì)
在常規(guī)建庫(kù)過(guò)程中，擴(kuò)增酶存在引入錯(cuò)誤的可能，通過(guò)循環(huán)擴(kuò)增, 這些錯(cuò)誤會(huì)被積累放大，降低了DNA序列復(fù)制的保真性。此外，DNA聚合酶還具有一定的擴(kuò)增偏向性，尤其是針對(duì)GC含量差異大或者二級(jí)結(jié)構(gòu)等區(qū)域，擴(kuò)增效率低，覆蓋均一性差；在引入錯(cuò)誤InDel的同時(shí)，還會(huì)帶來(lái)大量的Duplication，造成DNA數(shù)據(jù)量的浪費(fèi)，增加測(cè)序成本。而PCR-Free技術(shù)則能很好地規(guī)避常規(guī)建庫(kù)中因PCR擴(kuò)增而引入的上述問(wèn)題，具體優(yōu)勢(shì)如下圖所示。
圖2：PCR-Free技術(shù)優(yōu)勢(shì)
PCR-Free數(shù)據(jù)展示
1.華大平臺(tái)Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit （Cat#13321）PCR-free建庫(kù)，相同投入量，不同的打斷時(shí)間，均能獲得良好的純化回收率和環(huán)化效率。具體數(shù)據(jù)如下表：
表1：MGI平臺(tái)PCR-Free建庫(kù)數(shù)據(jù)
建庫(kù)方法 | 打斷酶 | 打斷時(shí)間（min） | gDNA投入量 （ng） | 純化回收率 | ERA投入量 （ng） | ssCir總量 （ng） | 環(huán)化效率 |
PCR-free建庫(kù) | Yeasen | 7 | 200 | 46.50% | 93 | 20 | 21.51% |
8 | 200 | 42.50% | 85 | 15 | 17.65% | ||
9 | 200 | 44.00% | 88 | 18 | 20.45% | ||
9 | 200 | 41.75% | 83.5 | 21.5 | 25.75% |
2.Illumina平臺(tái)Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit（Cat#12204）與En*建庫(kù)試劑盒進(jìn)行PCR-Free建庫(kù)實(shí)驗(yàn)。上機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：12204測(cè)序數(shù)據(jù)更佳。
表2：Illumina平臺(tái)PCR-Free測(cè)序數(shù)據(jù)
建庫(kù)方法 | 試劑盒 | 酶切時(shí)間（min） | gDNA投入量（ng） | 接頭連接產(chǎn)物（ng） | 雙輪分選產(chǎn)物（ng） |
PCR-Free建庫(kù) | 12204 | 12 | 500 | 380 | 76 |
En* | 15 | 500 | 420 | 81 |
clean_base (G) | clean_q20 (%) | clean_q30 (%) | clean/raw (%) | map_ratio (%) | Adapter (%) | Dup (%) | GC (%) | Depth | Coverage (%) |
42.5196 | 98.597 | 95.505 | 95.38 | 99.54 | 4.73 | 7.3646 | 41.218 | 14.77 | 99.3671 |
17.0161 | 98.497 | 95.279 | 93.34 | 99.57 | 3.67 | 5.4718 | 41.203 | 5.89 | 97.4356 |
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