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靶標(biāo)伴“His”，蛋白純化明明白白！
蛋白純化簡介
蛋白純化是將目標(biāo)蛋白從實驗樣本的總蛋白中分離出來，同時仍保留目的蛋白的生物學(xué)活性及化學(xué)完整性。在構(gòu)建載體階段，除了一些必要的表達(dá)元件，還需要考慮的密碼子優(yōu)化以及標(biāo)簽的選擇。選擇合適的標(biāo)簽不但有利于蛋白的純化，促進(jìn)蛋白的可溶性，同時也不能影響蛋白的結(jié)構(gòu)功能和下游應(yīng)用。以下簡單列舉幾個常見蛋白標(biāo)簽：
表1 不同蛋白純化標(biāo)簽介紹
標(biāo)簽 | 大小kDa | 序列 | 純化效價 | 標(biāo)簽切除 |
HIS標(biāo)簽 | ~0.84 | HHHHHH | + | TEV蛋白酶 |
GST | 26 |
| + | 3C蛋白酶/PSP |
MBP | 42 |
| + | Factor Xa、EK |
FLAG | 1.01 | DYKDDDDK | + | EK |
V5 | ~1.5 | GKPIPNPLLGLDST |
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Myc標(biāo)簽 | 1.2 | EQKLISEEDL |
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HA標(biāo)簽 | 1.1 | YPYDVPDYA |
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濃縮的精華，純化的*
His-Tag 為何會逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品///有效的技術(shù)之一。其主要優(yōu)勢在于：
高序列兼容性：N-端的His-tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容，有利于蛋白表達(dá)；
小序列影響小：His-tag非常小，His-tag對目的蛋白本身特性幾乎沒有影響，不會改變目的蛋白本身的可溶性和生物學(xué)功能；且在融合蛋白結(jié)晶后對蛋白的結(jié)構(gòu)沒有影響；
免疫原性低：His-tag的免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射入動物體內(nèi)進(jìn)行免疫并制備抗體；
聯(lián)合使用性強(qiáng)：與其他的親和標(biāo)簽構(gòu)建成親和標(biāo)簽，并可用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；
適用范圍廣：his標(biāo)簽融合蛋白的適用范圍也較廣，即可用在非離子型表面活性劑存在的條件下純化，也可以在變性條件下進(jìn)行純化。前者通常用來純化疏水性強(qiáng)的目的蛋白，而后者則通常純化包涵體蛋白。
因此，His逐漸成為了蛋白純化的首///選標(biāo)簽。
Yeasen His純化樹脂生產(chǎn)工藝
Yeasen生物自主研發(fā)的HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法偶聯(lián)四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni2+）后，形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)可保護(hù)鎳離子免受小分子的進(jìn)攻，與Ni-IDA樹脂相比，更加穩(wěn)定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。已經(jīng)成為實驗室純化His標(biāo)簽蛋白*的樹脂之一
圖1 His樹脂的產(chǎn)品原理圖
產(chǎn)品特性
圖2 His樹脂的產(chǎn)品特性
蛋白純化流程圖
1）裝柱：將HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用裝入合適的純化重力柱中；
2）清洗：3-5倍柱體積去離子水沖洗重力柱；
3）平衡：至少5倍柱體積的Lysis Buffer 平衡含有填料的重力柱；
4）上樣：注意控制加樣速度，耐壓0.1 MPa，流速控制在10滴/min，確保目的蛋白與Ni2+充分接觸，以提高純化得率；
5）洗雜，低濃度咪唑的緩沖液進(jìn)行洗雜；
6）洗脫：使用5-10倍柱料體積Elution Buffer洗脫，收集洗脫液即目的蛋白溶液。
圖2 His 蛋白純化簡易流程圖
HisSep Ni-NTA Agarose Resin測試數(shù)據(jù)
測試產(chǎn)品：
1、某his純化產(chǎn)品；
2、大量生產(chǎn)的FF高流速產(chǎn)品；
3、小樣生產(chǎn)的FF高流速產(chǎn)品；
4、本次生產(chǎn)的普通級別的his樹脂（20502ES）；
緩沖液：各個處理組均為1ml樹脂純化200 ml菌液；洗雜使用25mM的咪唑，洗脫液為250mM的咪唑。
測試報告一：His純化樹脂結(jié)合效率測試，與市場進(jìn)行對比，Yeasen研發(fā)的20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4號）具有良好的結(jié)合效率。如下圖：
圖3 His純化樹脂結(jié)合效率測試
測試報告二：以常利用的變性劑尿素為例，分別進(jìn)行了不同產(chǎn)品在8M尿素下耐受性測試， 20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4號）對尿素的耐受良好，與市場無差異。如下圖：
圖4 His樹脂對8M尿素耐受性測試
測試報告三：對于20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin（4號）進(jìn)行了批次檢測穩(wěn)定性測試，從結(jié)果看批次間差異基本控制在5%以內(nèi)，以保證更好的穩(wěn)定性。如下圖：
圖5 His純化樹脂的批次間比較
FAQ
常見問題 | 原因 | 優(yōu)化建議 |
洗脫組分中無目的蛋白 | 蛋白可能是包涵體 | 可通過電泳檢測裂解液，分析上清中是否有目的蛋白，包涵體蛋白需按照包涵體蛋白的純化方式 |
表達(dá)量太低 | 優(yōu)化表達(dá)條件，使用包涵體純化緩沖體系 | |
目的蛋白結(jié)合比較弱，在洗雜步驟中已被洗下來 | 提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑濃度 | |
目的蛋白結(jié)合過強(qiáng)，不容易洗脫下來 | 降低Elution Buffer的pH，或者增加Elution Buffer中的咪唑濃度；使用10-100 mM EDTA溶液剝離鎳離子，同時得到蛋白 | |
洗脫組分不純（含多種蛋白） | 洗雜不* | 增加Wash Buffer 體積 |
樣品中含有其他His標(biāo)簽蛋白 | 通過調(diào)節(jié)pH值或咪唑濃度來優(yōu)化洗雜條件。再使用其他純化手段（如去離子交換，疏水等）進(jìn)一步純化洗脫組分。 |
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格（mL） |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂） | 20502ES10/50/60/80 | 10/50/100/1000 |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF （His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂） | 20503ES10/50/60/80 | 10/50/100/1000 |
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5mL （His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱，5 mL） | 20504ES08/25 | 5/5×5 |
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 1mL（His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱，1 mL） | 20505ES03/08 | 1/1×5 |
Anti-His Affinity Gel（Anti-His標(biāo)簽親和純化凝膠） | 20589ES03/08/25/60 | 1/5/25/100 |
Imidazole咪唑 | 20501ES60/76 | 100 g/500g |
