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產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES25 | 25 T | 3465 |
11355ES50 | 50 T | 6455 | |
11355ES60 | 100 T | 9945 |
產(chǎn)品描述
CRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術(shù)，源于細菌和古細菌為應(yīng)對噬菌體和外源質(zhì)粒的攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機制。在現(xiàn)代生物技術(shù)研究中，此系統(tǒng)是通過人工優(yōu)化的具有引導(dǎo)作用的sgRNA(Single Guide RNA)引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與sgRNA配對的靶位點處剪切雙鏈DNA，從而引起DNA斷裂。由于生物體內(nèi)非同源末端修復(fù)機制或同源重組機制修復(fù)DNA，導(dǎo)致基因移碼突變、替換或刪除，致使基因功能喪失。
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit采用T7 RNA聚合酶混合物高效轉(zhuǎn)錄spCas9 sgRNA。本試劑盒含有能被Cas9蛋白識別并起支架作用的特異性序列，該序列的一部分能與使用者設(shè)計的目標特異序列部分重疊。退火形成互補鏈后由DNA聚合酶進行填充。終生成用于轉(zhuǎn)錄的dsDNA模板。本試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設(shè)計的特異性DNA序列，單管反應(yīng)可在4小時內(nèi)獲得20-100μg具有功能的sgRNA。
產(chǎn)品組分
編號 | 組分 | 產(chǎn)品編號/規(guī)格 | ||
11355ES25 (25 T) | 11355ES50 (50 T) | 11355ES60 (100 T) | ||
11355-A | 10×sgRNA Enzyme Mix | 50 μL | 100 μL | 200 μL |
11355-B | 10×sgRNA Reaction Buffer | 50 μL | 100 μL | 200 μL |
11355-C | 2×Canace Enzyme Mix | 312.5 μL | 625 μL | 1.25 mL |
11355-D | Scaffold Template | 31.25 μL | 62.5 μL | 125 μL |
11355-E | NTPs（25mM each） | 200 μL | 400 μL | 800 μL |
11355-F | Control sgRNA Oligo（10μM） | 10 μL | 20 μL | 40 μL |
運輸儲存方法
干冰運輸。-20℃保存，有效期兩年。
注意事項
1. 反應(yīng)體系中須嚴格注意不要混入RNase。
2. 實驗器材（如：槍頭、產(chǎn)品管等）注意嚴格使用 RNase Free用品。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
合成原理
操作流程
1. 上游引物（Target-specific sgRNA oligo）設(shè)計
A. 引物的5’端：T7啟動子序列加保護堿基（20nt：TTCTAATACGACTCACTATA）
B. 轉(zhuǎn)錄起始位點：添加0~2個G，添加G的個數(shù)由靶序列的5’端決定，T7啟動子至少需要2個G才能有效轉(zhuǎn)錄。
（注：若特異靶序列已經(jīng)存在2個G，則不需要額外添加，額外的G會降低剪切效率。）
C. 特異的sgRNA靶序列（20nt）：靶DNA序列PAM（NGG）的5’端20nt堿基序列。
D. 引物的3’端：Scaffold Template退火序列（14nt：GTTTTAGAGCTAGA）。
示例：
DNA模板：
上游引物（Target-specific sgRNA oligo）：
2. sgRNA合成
A.sgRNA模板擴增
①按下列體系配制反應(yīng)體系：
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
RNase free H2O | Up to 25 | - |
Scaffold Template | 1.25 | - |
sgRNA Oligo（10μM） | 1.25 | 0.5μM |
2×Canace Enzyme Mix | 12.5 | 1× |
注： 1. Scaffold Template已預(yù)先與下游引物混合。
2. 使用試劑、容器等無RNase污染。
②PCR反應(yīng)程序：
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
變性 | 98℃ | 10s | 30 |
延伸 | 68℃ | 10s | |
保持 | 4℃ | ∞ |
③電泳檢測：
使用2%瓊脂糖膠，取5μL PCR反應(yīng)液電泳檢測條帶大小及亮度，用100bp DNA Ladder（貨號：10507）標定，其大小為120bp左右單一條帶。
B.體外轉(zhuǎn)錄sgRNA
①按下列體系室溫配制反應(yīng)體系：
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
RNase free H2O | Up to 20 | - |
10×sgRNA Reaction Buffer | 2 | 1× |
NTPs (25 mM each) | 8 | 10 mM each |
sgRNA模板（上述A獲得） | 5 | - |
10×sgRNA Enzyme Mix | 2 | 1× |
注： 1. 低溫配置可能引起DNA模板沉淀。
2. 使用試劑、容器等無RNase污染。
②反應(yīng)程序：
溫度 | 時間 |
37℃ | 4h |
4℃ | ∞ |
注：反應(yīng)于PCR儀中進行，熱蓋打開，防止長時間導(dǎo)致反應(yīng)液蒸發(fā)。
③DNA模板消化：
反應(yīng)完成后，每管加入2μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育15min以去除模板DNA。
④轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化：
體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可選用 RNA Cleaner 磁珠進行純化（貨號：12602），也可以采用酚/氯坊純化法（具體操作步驟可聯(lián)系Yeasen索取），以去除蛋白、游離的核苷酸等。
HB200916
