轉(zhuǎn)染效率低？小翊手把手教你做轉(zhuǎn)染實驗

細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層和鑲嵌蛋白組成的，帶有負(fù)電荷。因此帶有負(fù)電荷的DNA或RNA無法通過細(xì)胞膜。為了讓核酸（DNA或RNA）通過細(xì)胞膜，研究人員利用不同的方法，包括使用化學(xué)物質(zhì)和包被核酸的載體分子進(jìn)行中和，以及在細(xì)胞膜上開孔等物理方法，將核酸（DNA或RNA）直接運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。這些就是轉(zhuǎn)染的過程，轉(zhuǎn)染的目的是促進(jìn)蛋白合成，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長與發(fā)育等，目前越來越多地被用到功能研究中。

圖1 DNA/RNA轉(zhuǎn)染過程（圖片來源：圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

1.常見轉(zhuǎn)染方法

根據(jù)導(dǎo)入的核酸在目的細(xì)胞中存活時間的長短，可以將轉(zhuǎn)染技術(shù)分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。也可以根據(jù)轉(zhuǎn)染方式的不同，分為化學(xué)轉(zhuǎn)染，物理轉(zhuǎn)染、和生物轉(zhuǎn)染方法。例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、陽離子聚合物PEI轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)、顯微注射、以及慢病毒包裝轉(zhuǎn)染等等。

但是，沒有一種轉(zhuǎn)染試劑可以滿足所有的實驗要求。必須根據(jù)您的細(xì)胞類型（原代細(xì)胞、貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞）、外源核酸種類（DNA、RNA）、基因表達(dá)時間、細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率等，操作是否簡便等因素，挑選出///理想的轉(zhuǎn)染試劑。

 圖2不同轉(zhuǎn)染方法的原理和優(yōu)點

在轉(zhuǎn)染過程中，即使選對了合適的轉(zhuǎn)染試劑，還是不可避免會出現(xiàn)各種令人頭疼的問題，例如，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞死亡，重復(fù)性差等問題。對于這些問題，我們接下來會詳細(xì)剖析。

2.轉(zhuǎn)染效率低

2.1轉(zhuǎn)染前

1）核酸純度不夠，比如DNA/RNA不純、質(zhì)粒中含有內(nèi)毒素、核酸不完整、核酸濃度過低均會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。建議使用高純度的DNA或RNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

2）要檢測所用的無血清培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染試劑的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 與轉(zhuǎn)染試劑不相容。

3）用了含有血清的培養(yǎng)基制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。血清會降低復(fù)合物的形成。建議用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA/RNA和轉(zhuǎn)染試劑。

4）DNA或RNA的復(fù)合物形成的比例，一般DNA（µg）：轉(zhuǎn)染試劑（µL）=1:2~1:3；而RNA（ng）：轉(zhuǎn)染試劑（µL）=9:1~3:1。

5）復(fù)合物孵育時間過短，未能充分形成復(fù)合物。建議復(fù)合物孵育時間10~20 min。

6）轉(zhuǎn)染試劑保存不當(dāng)，降低轉(zhuǎn)染效率。保存在4 ºC冰箱，不可凍存，避免反復(fù)長時間開蓋。

2.2轉(zhuǎn)染時

7）細(xì)胞密度過低或過高。DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度90%~95%，RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度30%~50%。

8）細(xì)胞生長狀態(tài)不佳。清除支原體、真菌、細(xì)菌等污染，保證提供新鮮的生長培養(yǎng)基。

9）轉(zhuǎn)染時細(xì)胞上清液中含有抗生素、生長因子等，大大降低轉(zhuǎn)染效率。

2.3轉(zhuǎn)染后

10) 轉(zhuǎn)染時間過短。一般質(zhì)粒表達(dá)水平在24~48h，mRNA表達(dá)水平在24~72 h，蛋白表達(dá)水平在48~96 h。

3.細(xì)胞毒性大

3.1轉(zhuǎn)染前

1）核酸純度不純也會造成細(xì)胞毒性。要確保質(zhì)粒中無內(nèi)毒素，使用高純度的DNA或RNA會降低細(xì)胞毒性。

2）轉(zhuǎn)染試劑過量。優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑的用量，以及優(yōu)化復(fù)合物的比例。

3）要檢查稀釋復(fù)合物的培養(yǎng)基與細(xì)胞的相容性，已知DMEM培養(yǎng)基對一些昆蟲細(xì)胞系有毒性。建議選擇合適的培養(yǎng)基。

3.2轉(zhuǎn)染時

4）細(xì)胞密度過低，會導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡。DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度90%~95%，RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度30%-50%。

5）細(xì)胞生長狀態(tài)不佳。清除支原體、真菌、細(xì)菌等污染，保證提供新鮮的生長培養(yǎng)基。

3.3轉(zhuǎn)染后

6）轉(zhuǎn)染后目的蛋白的過度表達(dá)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。建議及時更換新鮮培養(yǎng)基，或者添加一些營養(yǎng)物質(zhì)。

7）轉(zhuǎn)染后表達(dá)蛋白對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。建議換一種細(xì)胞系重新轉(zhuǎn)染。

8）轉(zhuǎn)染時間過短，就進(jìn)行抗性篩選。一般質(zhì)粒表達(dá)水平在24~48h，mRNA表達(dá)水平在24~72 h，蛋白表達(dá)水平在48~96 h。

9）抗性篩選時，加入的抗生素濃度過高。適當(dāng)降低抗生素的濃度。

4.重復(fù)性差

4.1轉(zhuǎn)染前

1）移液誤差。將DNA/RNA和轉(zhuǎn)染試劑充分打勻后，用移液器緩慢均勻的吸取，避免產(chǎn)生誤差。

2）制備復(fù)合物時，未充分混勻。將DNA/RNA和轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，并保證相同的孵育時間。

4.2轉(zhuǎn)染時

3）細(xì)胞密度存在差異。一般在特定的密度范圍內(nèi)，細(xì)胞密度越低，轉(zhuǎn)染效率越低，相反越高。

4）細(xì)胞生長狀態(tài)存在差異。好的細(xì)胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染效率越高。

5）細(xì)胞傳代次數(shù)不同。對于多次傳代的細(xì)胞，細(xì)胞的基因組和表型都會發(fā)生變化，不建議使用傳代次數(shù)過多的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。

4.3轉(zhuǎn)染后

6）轉(zhuǎn)染時間不一致，表達(dá)的蛋白水平會有差異。

5.相關(guān)文獻(xiàn)及產(chǎn)品

已發(fā)表文章

[1] Chen T, Chen Y, Chen H, et al. Dual-enzyme-propelled unbounded DNA walking nanomachine for intracellular imaging of lowly expressed microRNA[J]. Nano Research, 2019, 12(5): 1055-1060. （IF 8.21）

[2] Zhang X, Qi Z, Yin H, et al. Interaction between p53 and Ras signaling controls cisplatin resistance via HDAC4-and HIF-1α-mediated regulation of apoptosis and autophagy[J]. Theranostics, 2019, 9(4): 1096.  (IF 8.12)

[3] Zhang K, Zhao X, et al. Enhanced Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 Sep 12;10(36):30081-30091.（IF 8.09）

[4] Chen Y, Hao Q, Wang J, et al. Ubiquitin ligase TRIM71 suppresses ovarian tumorigenesis by degrading mutant p53[J]. Cell Death and Disease, 2019, 10(10): 1-14. (IF 5.72)

相關(guān)產(chǎn)品