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干貨分享|qPCR復(fù)孔平臺期熒光信號不同會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？
王老師：您好，近用你們的試劑跑qPCR，復(fù)孔平臺期的熒光信號不同，這樣的結(jié)果能用嗎？
小翊：您好，老師。從圖中來看，復(fù)孔重復(fù)性是比較好的，△Ct值<0.5, 這個結(jié)果沒什么問題的。
王老師：那為什么復(fù)孔的平臺期信號還有相差呢？有什么方法可以使復(fù)孔熒光信號一致嗎？
近有不少客戶咨詢小翊類似的問題，擔(dān)心這樣的數(shù)據(jù)不可靠今天小翊就幫您解除疑慮！
復(fù)孔平臺期不同不會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（△Ct<0.5）
*，理想的PCR擴(kuò)增是使DNA分子由1變2，2變4，以2n進(jìn)行擴(kuò)增的。但實(shí)際上，隨著循環(huán)數(shù)的增加，體系中的Taq酶、dNTP、引物等逐漸被消耗并伴隨著副產(chǎn)物的生成，使得PCR不能呈指數(shù)擴(kuò)增，從而使實(shí)際的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)“S”型，通常分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期三個階段，如圖1。
基線期是指PCR開始的3-15個循環(huán)時期，這段時期擴(kuò)增是存在的，但因循環(huán)次數(shù)較少，體系中雙鏈DNA積累較少，熒光信號強(qiáng)度沒有超過熒光本底信號，此時的熒光值對于機(jī)器來說很難準(zhǔn)確檢測。指數(shù)擴(kuò)增期是指PCR產(chǎn)物的量增長//快的一個時期，理想條件下，是呈指數(shù)增長的，在這個時期由于樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，所以復(fù)孔的熒光信號在這個時期相對一致。通常熒光閾值需要設(shè)置在此時期，熒光信號達(dá)到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱之為Ct值，故各復(fù)孔間的Ct值有較好的重復(fù)性（△Ct＜0.5）。而平臺期是指由于原料耗盡、反應(yīng)副產(chǎn)物的產(chǎn)生等原因使得擴(kuò)增變得緩慢的一個時期。此時期經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)較多，使樣品間的細(xì)小差異被無限放大，從而導(dǎo)致復(fù)孔間平臺期的熒光信號相差很大。
圖1 擴(kuò)增曲線的三個階段
下面為大家展示一個案例，以293T-cDNA的20倍稀釋液為模板，擴(kuò)增GAPDH基因，90個復(fù)孔（如圖2）。
圖2 同一樣品的90個重復(fù)的擴(kuò)增曲線圖
由圖可以看出該實(shí)驗(yàn)的復(fù)孔重復(fù)性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE標(biāo)準(zhǔn)。但平臺期的熒光信號值均有差異。
綜上：數(shù)據(jù)的有效性和復(fù)孔平臺期熒光信號關(guān)系不大，主要與復(fù)孔間的△Ct有關(guān)，MIQE標(biāo)準(zhǔn)是△Ct＜0.5。
在復(fù)孔△Ct<0.5的情況下，復(fù)孔平臺期不同并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是有沒有辦法可以讓復(fù)孔平臺期熒光信號盡量一致呢？
使復(fù)孔平臺期熒光信號趨于一致的秘訣
1、確保加樣的準(zhǔn)確性
1）qPCR各組分*化凍需要混勻。
2）采用預(yù)混的方式進(jìn)行加樣，保證體系的均一性。可以將除模板以外的試劑進(jìn)行預(yù)混，分注至各管中。
3）模板濃度高時，可將模板稀釋，提高加樣體積，減少加樣誤差。
2、確保移液的精///準(zhǔn)度
加樣過程需確保移液槍未出現(xiàn)漏氣、漏液的情況，避免使用精///準(zhǔn)度差的移液槍或者不配套的槍頭。
3、體系混勻并進(jìn)行離心
體系加完后要用移液槍吹打并進(jìn)行離心，以防試劑掛壁或者體系中有氣泡造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。
4、qPCR試劑的選擇：選擇“預(yù)混液”形式的qPCR試劑，反應(yīng)體系只需加入引物和模板，大大簡化實(shí)驗(yàn)的操作步驟，減少了加樣誤差。
好了，讀到這里，您應(yīng)該不會再用糾結(jié)復(fù)孔平臺期熒光信號不同的事了吧？為了簡化您的qPCR實(shí)驗(yàn)操作，讓您的qPCR數(shù)據(jù)更完美，小翊為您推薦一款SYBR Green預(yù)混液：Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat 11184ES），該產(chǎn)品是預(yù)混液形式的qPCR試劑，另外適合于所有的qPCR儀器平臺（如圖3），兼容快速程序，可以大大簡化您的實(shí)驗(yàn)操作并能保證您實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。
圖3. 適合于所有的qPCR儀器平臺
