一夫當(dāng)關(guān)，莫如雙管齊下

——聚焦熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶雙封閉抗體

當(dāng)下基于PCR技術(shù)的核酸檢測(cè)仍有其應(yīng)用難點(diǎn)

難點(diǎn)→檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性

核酸檢測(cè)行業(yè)人都格外關(guān)注檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性，不管是長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性還是短期偏離正常保存條件的穩(wěn)定性，都直接影響檢測(cè)結(jié)果的有效性。而短期偏離正常保存條件的穩(wěn)定性在實(shí)際使用和運(yùn)輸過程中尤為重要，比如遇到樣本量大、適配自動(dòng)化、排隊(duì)等待上機(jī)等情況，反應(yīng)體系需要在室溫或4℃放置，再比如遇到運(yùn)輸時(shí)間長(zhǎng)，溫度難以控制，檢測(cè)體系就暴露在風(fēng)險(xiǎn)之下。如何保證穩(wěn)定性，如何確保檢測(cè)結(jié)果有效、可信，是行業(yè)關(guān)注的難點(diǎn)。

難點(diǎn)→非特異性擴(kuò)增

非特異性擴(kuò)增直接影響檢測(cè)結(jié)果的判讀，還消耗反應(yīng)體系中的引物等物料，導(dǎo)致目的基因擴(kuò)增失敗。試劑開發(fā)人員通過優(yōu)化引物、調(diào)整鎂離子濃度和酶量、調(diào)整退火溫度等方法避免非特異性擴(kuò)增，但仍需謹(jǐn)慎操作，稍不留意也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)失敗。

熱啟動(dòng)DNA聚合酶可幫助攻克核酸檢測(cè)應(yīng)用難點(diǎn)

目前常用抗體法熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶幫助提升試劑穩(wěn)定性和解決非特異性擴(kuò)增問題。傳統(tǒng)的抗體法熱啟動(dòng)，是利用Taq DNA聚合酶抗體封閉其5'→3'聚合酶活性，防止在低溫時(shí)錯(cuò)配或引物二聚體引起非特異性擴(kuò)增，在PCR預(yù)變性95℃加熱時(shí)，抗體蛋白變性，釋放DNA聚合酶活性，不影響正常擴(kuò)增。利用抗體封閉聚合酶活性，可謂一夫當(dāng)關(guān)，萬夫莫開。

一夫當(dāng)關(guān)，莫如雙管齊下——翊圣帶來雙封閉抗體

聚合酶活性封閉抗體可以有效防止錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增，提升了全預(yù)混反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，然而Taq DNA聚合酶除了具有5'→3'聚合酶活性，還有5'→3'核酸外切酶活性，這部分外切酶活性可能會(huì)在低溫時(shí)導(dǎo)致錯(cuò)配探針或其它物料降解，造成非特異信號(hào)。因此翊圣開發(fā)了雙封閉抗體，不僅可以封閉Taq DNA聚合酶的聚合酶活性，還能同時(shí)封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，又能防止物料降解產(chǎn)生非特異信號(hào)，雙重提升試劑穩(wěn)定性，使檢測(cè)試劑在運(yùn)輸或室溫使用過程中都能夠從容應(yīng)對(duì)。

圖1. 傳統(tǒng)抗體法封閉原理示意圖

圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結(jié)構(gòu)域，抗體只封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性

圖2. 翊圣雙封閉抗體封閉原理示意圖

圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結(jié)構(gòu)域和5'→3'核酸外切酶活性結(jié)構(gòu)域，翊圣雙封閉抗體含兩種抗體，可同時(shí)封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性

圖3. 雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測(cè)

設(shè)計(jì)引物探針配于反應(yīng)液中，40℃反應(yīng)，檢測(cè)熒光信號(hào)。

黃色為未封閉的Taq DNA聚合酶組

紫色為雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶組

由圖3可以看出雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

雙封閉抗體有效提升檢測(cè)試劑穩(wěn)定性

用傳統(tǒng)封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預(yù)混液，在4℃或37℃放置10天或1、3、5天，擴(kuò)增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒，觀察擴(kuò)增曲線和CT值變化，對(duì)比傳統(tǒng)封閉抗體和雙封閉抗體對(duì)全預(yù)混反應(yīng)液穩(wěn)定性的作用。

圖4. 傳統(tǒng)封閉抗體封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色為含引物探針全預(yù)混液4℃放置10天后擴(kuò)增曲線，紅色為4℃放置0天對(duì)照

圖5. 雙封閉抗體封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色為含引物探針全預(yù)混液4℃放置10天后擴(kuò)增曲線，紅色為4℃放置0天對(duì)照

由圖4、圖5可以看出，雙封閉抗體比傳統(tǒng)封閉抗體更能保持反應(yīng)液穩(wěn)定，有效提升檢測(cè)試劑穩(wěn)定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預(yù)混液4℃放置10天擴(kuò)增曲線和CT值無明顯變化。

圖6. 傳統(tǒng)封閉抗體封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色為含引物探針全預(yù)混液37℃放置5天后擴(kuò)增曲線

綠色為含引物探針全預(yù)混液37℃放置3天后擴(kuò)增曲線

黃色為含引物探針全預(yù)混液37℃放置1天后擴(kuò)增曲線

紅色為37℃放置0天對(duì)照

圖7. 雙封閉抗體封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色為含引物探針全預(yù)混液37℃放置5天后擴(kuò)增曲線

綠色為含引物探針全預(yù)混液37℃放置3天后擴(kuò)增曲線

黃色為含引物探針全預(yù)混液37℃放置1天后擴(kuò)增曲線

紅色為37℃放置0天對(duì)照

由圖6、圖7可以看出，雙封閉抗體比傳統(tǒng)封閉抗體更能保持反應(yīng)液穩(wěn)定，有效提升檢測(cè)試劑穩(wěn)定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預(yù)混液37℃放置1、3、5天CT值差小于0.2。

雙封閉抗體幫助解決基線上漂問題

某些引物配合特定buffer和儀器時(shí)，會(huì)出現(xiàn)基線上漂的情況。翊圣嘗試多種方法改善基線問題，發(fā)現(xiàn)雙封閉抗體更有利于基線平穩(wěn)。

圖8. N基因擴(kuò)增曲線圖

紅色為傳統(tǒng)封閉抗體封閉反應(yīng)液擴(kuò)增曲線

綠色為雙封閉抗體封閉反應(yīng)液擴(kuò)增曲線

圖9. ACT基因擴(kuò)增曲線圖

紅色為傳統(tǒng)封閉抗體封閉反應(yīng)液擴(kuò)增曲線

綠色為雙封閉抗體封閉反應(yīng)液擴(kuò)增曲線

由圖8、圖9可以看出特定引物和buffer下，使用雙封閉抗體可幫助解決基線上漂問題。

使用雙封閉抗體獲得良好線性

用雙封閉抗體封閉的反應(yīng)液擴(kuò)增100000、10000、1000、100拷貝ASF/ACT雙質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖10. 雙封閉反應(yīng)液制作ASF基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

ASF基因標(biāo)準(zhǔn)曲線R²：0.998，擴(kuò)增效率98.848%，線性良好，無非特異性擴(kuò)增。

圖11. 雙封閉反應(yīng)液制作ACT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

ACT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線R²：0.998，擴(kuò)增效率98.113%，線性良好，無非特異性擴(kuò)增。

翊圣生物提供高品質(zhì)核酸檢測(cè)試劑原料

翊圣生物十年匠心，專注于分子工具酶原料的生產(chǎn)和開發(fā)。翊圣生物憑借自身成熟抗體篩選平臺(tái)，以Taq DNA聚合酶為靶標(biāo)分子進(jìn)行封閉抗體的篩選，經(jīng)過多年的潛心研究與體系優(yōu)化開發(fā)出熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶雙封閉抗體，驗(yàn)證可封閉多種Taq DNA聚合酶突變體，目前已有克級(jí)現(xiàn)貨庫存，助力核酸檢測(cè)應(yīng)用。

產(chǎn)品信息

關(guān)于翊圣生物

上海翊圣生物科技有限公司（Yeasen Biotech Co., Ltd）成立于2009年，長(zhǎng)期專注于分子酶原料及建庫試劑盒等產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)。

我們的目標(biāo)讓下游企業(yè)節(jié)省更多的成本，為中國(guó)精///準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展貢獻(xiàn)自己的力量。

翊圣生物擁有*分子酶雙向技術(shù)平臺(tái)、大規(guī)模蛋白發(fā)酵純化技術(shù)平臺(tái)、高效抗體篩選技術(shù)平臺(tái)，目前已成功開發(fā)各類診斷分子酶、二代測(cè)序建庫酶等40余種，并實(shí)現(xiàn)工業(yè)放大。翊圣生物開發(fā)的PCR類、NGS類、體外診斷（IVD）和相關(guān)酶原料等產(chǎn)品獲得了廣大客戶的認(rèn)可。此外，我們還為工業(yè)客戶提供定制化開發(fā)服務(wù)，以滿足個(gè)性化需求。

HB200927