細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法正是基于凋亡細(xì)胞特殊的形態(tài)學(xué)改變和生物化學(xué)變化而設(shè)計(jì)的。

1） 細(xì)胞體積變小

2） 核固縮，核仁碎裂，染色質(zhì)密度增高

3） 胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞器密度增高

4） 細(xì)胞膜皺褶、卷曲、內(nèi)陷，并將胞質(zhì)和DNA分割包裹形成凋亡小體。

圖1. 1：對(duì)照組細(xì)胞，2-6：分別用不同濃度DHA誘導(dǎo)凋亡后的細(xì)胞狀態(tài)^[1]

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Ca²⁺、Mg²⁺依賴型核酸內(nèi)切酶與相關(guān)蛋白水解酶被激活，將DNA降解，形成長(zhǎng)度為180-200bp或其整倍數(shù)的DNA片段。

活細(xì)胞DNA：不斷裂，凝膠電泳為一正常條帶

壞死細(xì)胞DNA：隨機(jī)斷裂，凝膠電泳表現(xiàn)為彌漫連續(xù)模糊的條帶

凋亡細(xì)胞DNA：等腰梯形條帶

圖2. 泳道2：正常細(xì)胞DNA；泳道6：凋亡細(xì)胞DNA

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）可直接催化斷裂DNA的3′端的核酸聚合反應(yīng)，加入帶有熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素標(biāo)記的核苷酸，顯色反應(yīng)后可特異地進(jìn)行原位凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。正?；蛟鲋臣?xì)胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，故很少被染色。

圖3. YEASEN TUNEL-FITC試劑盒（點(diǎn)擊查看產(chǎn)品：CAT.40306）檢測(cè)凋亡細(xì)胞樣本

細(xì)胞凋亡早期， 磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine，PS)從細(xì)胞膜胞質(zhì)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外表面。Annexin V可與 PS 特異性結(jié)合，用Annexin V（熒光素或生物素標(biāo)記）作為熒光探針，并與PI同時(shí)使用，借助FCM分析染色情況，其中Annexin V-／PI-、Annexin V+／PI+、Annexin V+／PI-、Annexin V-／PI+分別表示正常、晚期凋亡或壞死、早期凋亡和機(jī)械性損傷的細(xì)胞。

圖4. YEASEN Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（點(diǎn)擊查看產(chǎn)品:CAT.40302）檢測(cè)細(xì)胞凋亡

處于凋亡早期的細(xì)胞，在顯微鏡下還未出現(xiàn)顯著變化時(shí)，其膜電位已經(jīng)開始改變：膜通透性增加，跨膜電位下降。膜電位下降被認(rèn)為是凋亡最早的步驟，如果膜電位被破壞，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。一些親脂陽(yáng)離子熒光染料，如羅丹明123、JC-1等可與線粒體基質(zhì)緊密結(jié)合，細(xì)胞聚集染料能力的下降程度與膜電位的下降程度呈正相關(guān)。

圖5. YEASEN JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（點(diǎn)擊查看產(chǎn)品：CAT.40706）檢測(cè)膜電位變化^[3]

細(xì)胞的生命活動(dòng)都離不開 Ca²⁺ ，Ca²⁺超載時(shí)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，細(xì)胞內(nèi)外Ca²⁺平衡被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。用 Ca²⁺特異性熒光探針，如Rhod-2、Indo-1、Fluo-4等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，再用 FCM 或熒光、共聚焦激光顯微鏡檢測(cè)，可以準(zhǔn)確地得出細(xì)胞凋亡的生理指標(biāo)。

圖6. YEASEN Fluo-4， AM，細(xì)胞膜可滲透鈣離子熒光探針（點(diǎn)擊查看產(chǎn)品：CAT.40704）^[4]

細(xì)胞周期劃分為 G1 期、S 期、G2 期和 M 期，細(xì)胞凋亡后發(fā)生DNA斷裂，用碘化丙啶（PI）、苯基吲哚、吖啶橙等染色劑標(biāo)記 DNA，通過(guò)FCM分析，可以得到細(xì)胞各時(shí)期的分布狀態(tài)，可計(jì)算出各個(gè)時(shí)期細(xì)胞的比例，以判定細(xì)胞凋亡的程度和比率。

細(xì)胞凋亡時(shí)，DNA發(fā)生核小體間的斷裂，形成由DNA與組蛋白（包含 H、H2A、H2B、H3、H4 五組分）緊密結(jié)合的核小體單位的片段。采用雙抗體（抗組蛋白抗體和抗DNA抗體）夾心免疫法檢測(cè)細(xì)胞凋亡后形成的核小體，酶催化后形成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性定量分析細(xì)胞的凋亡情況。

caspase-3 被認(rèn)為是各種因素導(dǎo)致凋亡的關(guān)鍵酶，生理狀態(tài)下它以酶原的形式存在，它的活化預(yù)示著細(xì)胞執(zhí)行凋亡程序的開始，是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。目前，壞死細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)有caspase-3 的活化，因此，通過(guò)檢測(cè) caspase-3 活力強(qiáng)弱可判斷細(xì)胞是否凋亡或壞死。

細(xì)胞凋亡時(shí)某些基因表達(dá)異常產(chǎn)物，這些基因轉(zhuǎn)錄翻譯出來(lái)的產(chǎn)物可促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡，如細(xì)胞凋亡蛋白家族、凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）及 Fas等。這些相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)定可為細(xì)胞凋亡檢測(cè)提供依據(jù)。

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