Yeasen Hieff Clone® 一步法克隆試劑盒榮登《Cell》《Science》等國際頂尖期刊

提起“分子克隆"或“載體構(gòu)建"這兩個詞，大家可能最先想到的是傳統(tǒng)酶切酶連法，即用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生黏性末端，通過T4 DNA連接酶連接兩個片段的克隆方法。該方法存在著一些明顯的局限，如連接反應(yīng)時間長，操作繁瑣，克隆效率低，酶切位點的選擇易受到限制等。

為了提高克隆效率，節(jié)省反應(yīng)時間，基于同源重組酶的無縫克隆技術(shù)應(yīng)用而生。與傳統(tǒng)酶切酶連技術(shù)相比，無縫克隆技術(shù)操作簡單快速，不受到酶切位點的限制，可一次進行多個片段的拼接，大大的提高了克隆效率。

翌圣生物在成熟的工具酶表達純化平臺基礎(chǔ)上，獲得高純度重組酶，并反復(fù)優(yōu)化重組酶反應(yīng)微環(huán)境，研發(fā)出Hieff Clone®系列無縫克隆試劑盒。

Hieff Clone®克隆試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5'端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5'和3'末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的*一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應(yīng)15-20 min即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆，克隆陽性率可達95%以上。

? 無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。

?  設(shè)計簡單：在插入片段的PCR擴增引物5'端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。

?  快速高效：50℃，20 min即可完成重組反應(yīng)。克隆陽性率可達95%以上。

?  應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，高效克隆50 bp-10 kb片段；也可結(jié)合Canace高保真酶，應(yīng)用于定點突變。

?  線性化載體的制備：酶切或PCR制備線性化載體

?  插入片段的制備：在目的DNA片段上下游引物的5'端引入15-25 bp左右載體末端同源序列；PCR反應(yīng)擴增目的片段。

?  重組反應(yīng)：按比例混合線性化載體和目的DNA片段進行重組，50℃反應(yīng)15-20 min。

?  轉(zhuǎn)化、涂板：將重組產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后涂平板，陽性克隆鑒定。

圖1：Hieff Clone®一步法快速定向克隆試劑盒進行單片段和多片段克隆實驗流程圖。

? 單片段高效重組

圖2：Hieff Clone® One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長度的單片段基因。

A-D：重組轉(zhuǎn)化平板。E：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb，載體與插入片段摩爾比：1:3，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。

? 多片段輕松重組

圖3：Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit進行三片段克隆。

A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。C：PCR方法鑒定每個單片段和最終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。

?  長片段重組

實驗信息：載體大?。?/span>8000 bp，目的片段大小：7500 bp。

實驗數(shù)據(jù)：

圖5：使用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit進行克隆。

A：陰性對照轉(zhuǎn)化平板。B：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。C：載體和目的片段的濃度檢測電泳圖。D：菌落PCR鑒定電泳圖，箭頭指示目的條帶。 M₁：Marker Ⅲ；M₂：100 bp DNA ladder。(仁濟醫(yī)院)

?  多片段重組
實驗信息：載體大?。?/span>3996 bp；四個片段大?。?76 bp，867 bp，915 bp和647 bp。

實驗數(shù)據(jù)：

圖6：使用Hieff Clone® Multi One Step Cloning Kit進行克隆。

A：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。B：1為載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖。C：菌落PCR驗證結(jié)果，其中1為原始質(zhì)粒對照電泳，2-5為重組質(zhì)粒，僅檢測863bp的一個目的片段，6為假陽性。D：陽性克隆測序結(jié)果。M：Marker II。（微生物所)

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Q：Hieff Clone®克隆的原理是什么？

A：利用末端同源重組的原理。將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。

Q：與傳統(tǒng)克隆相比，Hieff Clone®克隆有什么優(yōu)勢？

A： 1）無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。

2）設(shè)計簡單：在插入片段的PCR擴增引物5'端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。

3）快速高效：50℃，20 min即可完成重組反應(yīng)?？寺￡栃月士蛇_95%以上。

4）應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結(jié)合Canace高保真酶，應(yīng)用于定點突變。

Q：同源序列長度對重組效率的影響？

A：同源序列的長度與克隆數(shù)目有相關(guān)性，一般同源片段選擇在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范圍內(nèi)調(diào)整。并且選擇盡量避免出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)。

Q：線性化載體和目的片段產(chǎn)物的質(zhì)量會影響重組反應(yīng)嗎？

A：線性化載體或目的片段品質(zhì)較差時會極大影響重組反應(yīng)，建議割膠回收純化產(chǎn)物。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒對感受態(tài)細胞有要求嗎？

A：推薦使用轉(zhuǎn)化效率為10⁸ cfu/μg的感受態(tài)細胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），TOP⑩（cat NO. 11801ES）等。

Q：線性化載體和目的片段擴增產(chǎn)物的使用量和比例？

A：載體使用量應(yīng)大于0.01 pmol，推薦使用量0.03 pmol；克隆載體與目的片段摩爾比應(yīng)在2:1-1:5范圍內(nèi)，最適為1:2-1:3，超過范圍可能會影響克隆效率。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒適用實驗有哪些？

A：本試劑盒適用于絕大多數(shù)基于常規(guī)“酶切-連接"方法的克隆實驗，并且特別適用于其它常規(guī)方法難以快速實現(xiàn)的基因多點突變、全基因合成等。

Q：多片段一步法快速定向克隆試劑盒可以用于單片段的克隆嗎？

A：多片段一步法克隆試劑盒可以用于單片段的克隆。但是，單片段克隆試劑盒不建議用于多片段的克隆，重組效率可能會受到影響。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒反應(yīng)溫度是50℃，是否可以在37℃進行反應(yīng)？

A：一般情況下建議在50℃進行反應(yīng)。50℃有利于消除DNA的二級結(jié)構(gòu)，同時是Hieff Clone®重組酶的最適反應(yīng)溫度。37℃反應(yīng)條件也可以進行重組反應(yīng)，請根據(jù)實驗需要進行優(yōu)化。

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