——更簡便、更靈敏、更準(zhǔn)確

自1990年螢光素酶生物傳感器技術(shù)誕生，時至今日，螢光素酶報(bào)告基因的檢測系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞信號通路、siRNA/miRNA、免疫應(yīng)答、藥物篩選等研究。螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)中具有代表性的是螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因和海腎螢光素酶報(bào)告基因，由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別，且在動物體內(nèi)無內(nèi)源性表達(dá)，使其在單、雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。

螢火蟲螢光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，大小為61KDa。在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化底物螢火蟲螢光素氧化，生成氧化螢光素，并發(fā)出黃綠色光，其*發(fā)光波長為560nm。

海腎螢光素酶也是一種胞內(nèi)蛋白，大小為36KDa。只需要氧氣就可以催化腔腸素，氧化生成高能產(chǎn)物coelenteramide，并發(fā)出藍(lán)光，其*發(fā)光波長為465nm。

對于螢光素酶的化學(xué)發(fā)光與檢測模式上存在以下差異：

? 化學(xué)發(fā)光根據(jù)發(fā)光的形式和種類分為閃光型（flash-type）與輝光型（glow-type）兩種類型；

? 在檢測方法上分為非均質(zhì)檢測與均質(zhì)檢測；

那么在螢光素酶檢測實(shí)驗(yàn)中如何進(jìn)行報(bào)告基因檢測試劑的選擇呢？接下來讓我們一探究竟~

1 閃光型與輝光型差異

2 非均質(zhì)型與均質(zhì)型差異

? 非均質(zhì)型

優(yōu)勢：可留樣檢測（裂解液可保存用于后續(xù)檢測）；劣勢：操作繁瑣。

? 均質(zhì)型

優(yōu)勢：操作簡單（裂解檢測僅需一步）；劣勢：不可留樣檢測。

好啦！以上說了這么多，相信大家已經(jīng)明確了自己的需求啦~

翌圣生物提供“非均質(zhì)法閃光型"和“均質(zhì)法輝光型" 螢光素酶檢測試劑，大家可以根據(jù)單、雙螢光素酶報(bào)告基因進(jìn)行選擇~

1 非均質(zhì)閃光型報(bào)告基因檢測（貨號：11401、11402）

? 產(chǎn)品特點(diǎn)

裂解能力更強(qiáng)：能夠*裂解絕大部分種類細(xì)胞。

信號更強(qiáng)：能夠精準(zhǔn)檢測弱啟動子的表達(dá)。

靈敏度更高：可檢測低至10‐20摩爾螢光素酶分子。

線性范圍更廣：線性檢測范圍超過酶濃度的8個數(shù)量級。

? 應(yīng)用方向

精準(zhǔn)測量轉(zhuǎn)錄調(diào)控，miRNA靶基因驗(yàn)證，信號通路，轉(zhuǎn)錄因子和啟動子研究等。

? 適用樣本

哺乳動物細(xì)胞、原生質(zhì)體、煙草葉片

? 數(shù)據(jù)展示

 

熒光強(qiáng)度媲美進(jìn)口品牌

圖1. Yeasen（貨號：11402）熒光強(qiáng)度與P品牌相當(dāng)，可替換進(jìn)口品牌。

信號檢測更強(qiáng)，淬滅*

圖2. Yeasen（貨號：11402）檢測試劑和螢光素酶相互作用，可獲得最佳的發(fā)光強(qiáng)度，加入海腎螢光素酶底物后，螢火蟲螢光素發(fā)光淬滅情況：基本能夠*淬滅。

2 均質(zhì)型輝光型報(bào)告基因檢測（貨號：11404、11405）

? 產(chǎn)品特點(diǎn)

信號穩(wěn)定：半衰期長（達(dá)2h），非常適用于高通量檢測，再也不用擔(dān)心螢光信號淬滅的問題。

操作簡便：只需要加樣-讀值，即可完成實(shí)驗(yàn)，擠出更多時間發(fā)paper。

準(zhǔn)確度高：我有海腎螢光素酶的底物——腔腸素，可校正孔間細(xì)胞數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率的誤差。

兼容性好：可用于多種常用細(xì)胞培養(yǎng)液，如RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12等。

無刺激性氣味：還你一個清新愉快的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

? 應(yīng)用方向

Fc effector檢測系統(tǒng)，信號通路，免疫檢查點(diǎn)檢測系統(tǒng)( immune checkpoint assays)，細(xì)胞因子、生長因子檢測和抗體內(nèi)化研究的檢測系統(tǒng)等。

? 適用樣本

哺乳動物細(xì)胞、原生質(zhì)體

? 數(shù)據(jù)展示

熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性媲美進(jìn)口品牌

圖3. Yeasen（貨號：11405）熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性與P進(jìn)口品牌相當(dāng)。

淬滅效果與進(jìn)口品牌相當(dāng)

圖4. Yeasen（貨號：11405）檢測試劑和螢光素酶相互作用，可獲得最佳的發(fā)光強(qiáng)度，加入海腎螢光素酶底物后，螢火蟲螢光素發(fā)光淬滅情況，淬滅效果與P進(jìn)口品牌相當(dāng)。

在不同培養(yǎng)基上能正常發(fā)光，且發(fā)光效果差異小于P進(jìn)口公司

圖5. Yeasen（貨號：11405）在常用培養(yǎng)基：DMEM、F12、MEMα、RPMI-1640中都可以正常發(fā)光，并且不同培養(yǎng)基中的發(fā)光效果差異小于P進(jìn)口公司。。

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Q1：雙螢光素酶報(bào)告基因最適反應(yīng)溫度？

A：室溫（20-22℃）。反應(yīng)時各個組分（細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫。此兩種螢光素酶的反應(yīng)速率是受溫度影響的，為了保證實(shí)驗(yàn)的一致性，我們推薦此兩種工作液在檢測時都孵育至室溫。

Q2：雙螢光素酶報(bào)告基因載體該如何選擇？

A：1）螢火蟲螢光素酶建議選取pGL-3或pGL-4或者自己構(gòu)建的載體。。

  2）海腎螢光素酶建議選取pRL-TK或pGL-4載體或者自己構(gòu)建相應(yīng)的載體。建議優(yōu)先選用中等強(qiáng)度的啟動子（如TK），而不使用強(qiáng)啟動子（如SV40、CMV），以免影響主報(bào)告基因的表達(dá)，或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)摸索選擇合適的載體。

Q3：檢測的熒光數(shù)值很低怎么辦？

A：檢測的熒光數(shù)值很低說明細(xì)胞裂解液中的螢光素酶含量很低。通常解決辦法為

1）轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染級別的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提。

2）優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，盡可能的提高轉(zhuǎn)染效率。

3）增加實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞量，并且裂解細(xì)胞時，適當(dāng)減少細(xì)胞裂解液的量。

Q4：進(jìn)行檢測的過程中，熒光信號值太高該如何進(jìn)行調(diào)整？

A：

1）在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后，減少細(xì)胞的孵育時間。

2）降低熒光信號采集時間。

3）進(jìn)行樣品的稀釋。

Q5：螢火蟲螢光素酶讀值和海腎螢光素酶讀值的比例多少時比較合適？

A：盡量保證對照組的螢火蟲螢光素酶的讀值和海腎螢光素酶的讀值接近，或者海腎螢光素酶的讀值比螢火蟲螢光素酶的讀值稍高。對于具體的實(shí)驗(yàn)過程中，由于螢火蟲螢光素酶質(zhì)粒和海腎螢光素酶的質(zhì)粒抽提的質(zhì)量不一致，待檢測目的調(diào)控元件的調(diào)控能力的不同等原因，一次實(shí)驗(yàn)很難達(dá)到一個比較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此對于此實(shí)驗(yàn)，我們推薦預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化螢火蟲螢光素酶質(zhì)粒和海腎螢光素酶質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染量。

Q6：細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染時使用96孔板還是6孔板或者其他規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板？

A：一般來說，如果能保證10%的轉(zhuǎn)染效率，96孔板的細(xì)胞量就能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。如果細(xì)胞很難轉(zhuǎn)染或者待檢測的調(diào)控原件的調(diào)控作用很弱，可以增加實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞量。

Q7：此試劑盒采用何種儀器和檢測板檢測比較好？

A：檢測儀器：能檢測化學(xué)發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同；檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標(biāo)板。黑色酶標(biāo)板也可用，但因黑色會吸收光信號，可能會降低信號。 

HB210811