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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：逆轉(zhuǎn)錄酶，你真的了解嗎？

2021-9-10　　閱讀(956)

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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：逆轉(zhuǎn)錄酶，你真的了解嗎？

通過上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：如何評估RNA質(zhì)量？》一文的學(xué)習(xí)。相信大家已經(jīng)獲得了優(yōu)質(zhì)的RNA，即將進(jìn)入逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)。


對于逆轉(zhuǎn)錄，大家都知道它是以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成互補DNA (complementary DNA，cDNA)的過程（如圖1）。但對于過程中起關(guān)鍵作用的逆轉(zhuǎn)錄酶，可能比較陌生。接下來，讓小翌給大家介紹下逆轉(zhuǎn)錄酶的相關(guān)理論知識。

圖1. 逆轉(zhuǎn)錄過程示意圖.png
圖1. 逆轉(zhuǎn)錄過程示意圖


逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)
1970年美國科學(xué)家Howard Temin和David Baltimore分別在動物致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，并因此獲得了1975年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。該發(fā)現(xiàn)揭示了生物體的遺傳信息不僅可以從DNA到DNA（DNA自我復(fù)制）、從RNA到RNA、從DNA到RNA（轉(zhuǎn)錄），還可以從RNA到DNA(逆轉(zhuǎn)錄)，進(jìn)而補全了中心法則（如圖2）。

圖2. 中心法則示意圖.png
圖2. 中心法則示意圖


逆轉(zhuǎn)錄酶的酶學(xué)特性

逆轉(zhuǎn)錄酶屬于DNA聚合酶的一類，可以聚合dNTP合成cDNA鏈，這一過程的發(fā)生，依賴于逆轉(zhuǎn)錄酶的2大活性：DNA聚合酶活性和RNase H活性。

DNA聚合酶活性：以RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA的3′末端以5′→3′方向合成DNA。值得注意的是該酶不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，會導(dǎo)致DNA出錯率比較高。
RNase H活性：DNA鏈容易與RNA鏈形成DNA-RNA雜交鏈，RNase H可以水解雜交鏈上的RNA。它是病毒生命周期中復(fù)制循壞所必需的，能限制逆轉(zhuǎn)錄酶的合成長度。


逆轉(zhuǎn)錄酶的種類
目前，市面上常用的兩種逆轉(zhuǎn)錄酶：AMV和M-MLV。它們擁有著不同的特征，如表1所示。

表1. M-MLV和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的特征比較


M-MLV

AMV

來源

莫洛尼鼠白血病病毒

禽成髓細(xì)胞瘤病毒

熱穩(wěn)定性

差，37-42℃

好，42-55℃

最適pH

7.6

8.3

RNase H活性

弱

強

cDNA合成得率

較高

低

合成長度

長，可達(dá)2-3kb

短

對抗復(fù)雜結(jié)構(gòu)RNA的能力

弱

強

優(yōu)勢

合成產(chǎn)物長度長、含量高

比M-MLV更耐熱，適合具有一定復(fù)雜結(jié)構(gòu)的RNA轉(zhuǎn)錄


雖然野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性差，抵抗復(fù)雜結(jié)構(gòu)的RNA能力弱，但通過對其進(jìn)行改造可彌補這些不足。漸漸地，改造后的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶成為了市場的主流產(chǎn)品。


翌圣Hifair®逆轉(zhuǎn)錄酶

為了提高M-MLV的逆轉(zhuǎn)錄能力，翌圣生物在野生型M-MLV的基礎(chǔ)上通過基因工程技術(shù)開發(fā)出了Hifair®系列逆轉(zhuǎn)錄酶，包括Hifair®Ⅱ和Hifair®Ⅲ系列逆轉(zhuǎn)錄酶。

其中Hifair®Ⅲ系列逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性高，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，非常適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。該酶缺失了RNaseH活性，提高了其延伸能力，其合成長度達(dá)19.8kb。此外，該酶增強了與模板的親和力，非常適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。


產(chǎn)品選擇指南


產(chǎn)品形式

產(chǎn)品名稱和編號

引物

適用實驗類型

產(chǎn)品特點

單酶

Hifair® II Reverse Transcriptase /11110ES

無

PCR/qPCR

A.逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃,30min

總RNA使用范圍：1ng-5μg

 合成cDNA長度：10kb

Hifair® III Reverse Transcriptase/11111ES

B.逆轉(zhuǎn)錄條件：55℃,15min

 總RNA使用范圍：10pg-5μg

 合成cDNA長度：19.8kb

酶和buffer 分開

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11119ES/11121ES

單獨成管的oligodT、random primer

 

PCR/qPCR

 

同A

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11139ES

同B

酶和buffer預(yù)混

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11120ES/11123ES

按比例預(yù)混的oligodT、random primer

qPCR

C.逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃,30min

總RNA使用范圍:1ng-5μg

2×預(yù)混液

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11141ES

D.逆轉(zhuǎn)錄條件：55℃,15min

 總RNA使用范圍：10pg-5μg

 4×預(yù)混液，可投入更大體積模板


Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶性能展示


◎ 可耐受60℃反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄


圖3. 以500ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板.png 
圖3. 以500ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板, 使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat 11139ES)在42℃-65℃下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取1μL cDNA為模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat 10148ES)擴增TFRC基因（4.4kb）。M:1kb DNA ladder.


◎ *的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA


圖4. 以500ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板.png

 
圖4. 以500ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板，oligodT為引物，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat .11139ES)合成cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat .10148ES)擴增DY1C1N1基因（19.9kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.


◎ 出色的逆轉(zhuǎn)錄效率，適合不同 GC 含量、不同表達(dá)豐度的基因


圖5. 以300ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板.png 
圖5. 以300ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板, 使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)混液 (Cat .11141ES)、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA為模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 預(yù)混液 (Cat .11195ES)擴增20個不同GC含量（25-65%）、不同表達(dá)豐度的基因。


◎ 線性檢測范圍廣，Total RNA 10pg-5μg


圖6. 以10pg-5μg的293T細(xì)胞的總RNA為模板.png 
圖6.以10pg-5μg的293T細(xì)胞的總RNA為模板，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)混液 (Cat .11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 預(yù)混液 (Cat .11195ES)擴增PTTG1基因。


相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品定位

產(chǎn)品名稱

貨號

規(guī)格

單酶

Hifair® II Reverse Transcriptase

11110ES92/93

1/5×10KU

高靈敏度單酶

Hifair® III Reverse Transcriptase

11111ES92/93

1/5×10KU

Kit

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11119ES60

100T

Kit(含gDNA去除步驟)

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit  (gDNA digester plus)

11121ES60

100T

高靈敏Kit（含gDNA去除步驟）

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

11139ES60

100T

預(yù)混液

Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix

11120ES60

100T

預(yù)混液（含gDNA去除步驟）

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)

11123ES60

100T

高靈敏預(yù)混液（含gDNA去除步驟）

Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES60

100T


▲ 點擊查看產(chǎn)品詳情


已發(fā)表文獻(xiàn)（部分）


[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）

[2]. Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493) 

[3]. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）

[4].  Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug  Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters,  2020.（IF12.279）

[5].  Xu L ,  Xu S ,  Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota  in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome,  2021, 9(1).(IF 11.607)

以上是小翌本期給大家分享的內(nèi)容，主要介紹了逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)、酶學(xué)特性和種類。下期，我們將告訴大家應(yīng)如何正確選擇逆轉(zhuǎn)錄引物，我們下期不見不散哦~



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