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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：逆轉錄酶，你真的了解嗎？
通過上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：如何評估RNA質量？》一文的學習。相信大家已經獲得了優(yōu)質的RNA，即將進入逆轉錄環(huán)節(jié)。
對于逆轉錄，大家都知道它是以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成互補DNA (complementary DNA，cDNA)的過程（如圖1）。但對于過程中起關鍵作用的逆轉錄酶，可能比較陌生。接下來，讓小翌給大家介紹下逆轉錄酶的相關理論知識。
圖1. 逆轉錄過程示意圖
圖2. 中心法則示意圖
逆轉錄酶屬于DNA聚合酶的一類，可以聚合dNTP合成cDNA鏈，這一過程的發(fā)生，依賴于逆轉錄酶的2大活性：DNA聚合酶活性和RNase H活性。
表1. M-MLV和AMV逆轉錄酶的特征比較
M-MLV | AMV | |
來源 | 莫洛尼鼠白血病病毒 | 禽成髓細胞瘤病毒 |
熱穩(wěn)定性 | 差，37-42℃ | 好，42-55℃ |
最適pH | 7.6 | 8.3 |
RNase H活性 | 弱 | 強 |
cDNA合成得率 | 較高 | 低 |
合成長度 | 長，可達2-3kb | 短 |
對抗復雜結構RNA的能力 | 弱 | 強 |
優(yōu)勢 | 合成產物長度長、含量高 | 比M-MLV更耐熱，適合具有一定復雜結構的RNA轉錄 |
雖然野生型M-MLV逆轉錄酶的熱穩(wěn)定性差，抵抗復雜結構的RNA能力弱，但通過對其進行改造可彌補這些不足。漸漸地，改造后的M-MLV逆轉錄酶成為了市場的主流產品。
為了提高M-MLV的逆轉錄能力，翌圣生物在野生型M-MLV的基礎上通過基因工程技術開發(fā)出了Hifair®系列逆轉錄酶，包括Hifair®Ⅱ和Hifair®Ⅲ系列逆轉錄酶。
產品形式 | 產品名稱和編號 | 引物 | 適用實驗類型 | 產品特點 |
單酶 | Hifair® II Reverse Transcriptase /11110ES | 無 | PCR/qPCR | A.逆轉錄條件：42℃,30min 總RNA使用范圍：1ng-5μg 合成cDNA長度：10kb |
Hifair® III Reverse Transcriptase/11111ES | B.逆轉錄條件：55℃,15min 總RNA使用范圍：10pg-5μg 合成cDNA長度：19.8kb | |||
酶和buffer 分開 | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11119ES/11121ES | 單獨成管的oligodT、random primer |
PCR/qPCR
| 同A |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11139ES | 同B | |||
酶和buffer預混 | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11120ES/11123ES | 按比例預混的oligodT、random primer | qPCR | C.逆轉錄條件：42℃,30min 總RNA使用范圍:1ng-5μg 2×預混液 |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11141ES | D.逆轉錄條件：55℃,15min 總RNA使用范圍：10pg-5μg 4×預混液，可投入更大體積模板 |
◎ 可耐受60℃反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄
圖3. 以500ng 293T細胞的總RNA為模板, 使用Hifair®Ⅲ逆轉錄酶 (Cat 11139ES)在42℃-65℃下進行逆轉錄。取1μL cDNA為模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat 10148ES)擴增TFRC基因（4.4kb）。M:1kb DNA ladder.
◎ *的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA
圖4. 以500ng 293T細胞的總RNA為模板，oligodT為引物，使用Hifair®Ⅲ逆轉錄酶 (Cat .11139ES)合成cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat .10148ES)擴增DY1C1N1基因（19.9kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.
◎ 出色的逆轉錄效率，適合不同 GC 含量、不同表達豐度的基因
圖5. 以300ng 293T細胞的總RNA為模板, 使用Hifair®Ⅲ逆轉錄酶預混液 (Cat .11141ES)、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA為模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 預混液 (Cat .11195ES)擴增20個不同GC含量（25-65%）、不同表達豐度的基因。
◎ 線性檢測范圍廣，Total RNA 10pg-5μg
圖6.以10pg-5μg的293T細胞的總RNA為模板，使用Hifair®Ⅲ逆轉錄酶預混液 (Cat .11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 預混液 (Cat .11195ES)擴增PTTG1基因。
產品定位 | 產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
單酶 | Hifair® II Reverse Transcriptase | 11110ES92/93 | 1/5×10KU |
高靈敏度單酶 | Hifair® III Reverse Transcriptase | 11111ES92/93 | 1/5×10KU |
Kit | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11119ES60 | 100T |
Kit(含gDNA去除步驟) | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11121ES60 | 100T |
高靈敏Kit（含gDNA去除步驟） | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11139ES60 | 100T |
預混液 | Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | 11120ES60 | 100T |
預混液（含gDNA去除步驟） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) | 11123ES60 | 100T |
高靈敏預混液（含gDNA去除步驟） | Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100T |
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[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
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[3]. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4]. Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5]. Xu L , Xu S , Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1).(IF 11.607)
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