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雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)~實(shí)驗(yàn)操作篇

2021-10-12　　閱讀(325)

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)~實(shí)驗(yàn)操作篇

自1990年螢光素酶生物傳感器技術(shù)誕生以來，單螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)到雙螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)手段。雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在單報(bào)告基因的基礎(chǔ)上引入了“內(nèi)參對(duì)照"報(bào)告基因，可以排除不同組之間細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。今天小翌將從雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)的原理與應(yīng)用開篇，給大家分享雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)操作流程。

一

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)原理

螢火蟲螢光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，大小為61KDa。在氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在的條件下，催化底物螢火蟲螢光素氧化，生成氧化螢光素，并發(fā)出黃綠色光，其*發(fā)光波長(zhǎng)為560nm。

海腎螢光素酶也是一種胞內(nèi)蛋白，大小為36KDa。只需要氧氣就可以催化腔腸素，氧化生成高能產(chǎn)物coelenteramide，并發(fā)出藍(lán)光，其*發(fā)光波長(zhǎng)為465nm。

海腎熒光素酶.jpg

二

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用

◆ microRNA研究

在報(bào)告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，就能用來檢測(cè)miRNA對(duì)于目的基因的調(diào)控（抑制作用），報(bào)告基因表達(dá)越少，說明miRNA的作用就越強(qiáng)。

◆ 轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究

在報(bào)告基因的5'端加上待檢測(cè)基因的啟動(dòng)子，就可以用來檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的作用，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄越多，那報(bào)告基因的表達(dá)量就越大，熒光值越高。

◆ 啟動(dòng)子研究

將啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建到luciferase報(bào)告載體中，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。

◆ 信號(hào)通路研究

信號(hào)通路的激活/監(jiān)測(cè)基因的表達(dá)水平。

......

三

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作流程

報(bào)告基因檢測(cè)流程主要有4個(gè)模塊：分別是質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

質(zhì)粒構(gòu)建

雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)一般將螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和海腎螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或?qū)⑦@兩個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建到同一個(gè)骨架質(zhì)粒上（如pGL4質(zhì)粒），分別用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)其表達(dá)。

◆ 主報(bào)告基因載體的選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇對(duì)應(yīng)的載體骨架。

如果是基因調(diào)控研究，需要選擇不帶啟動(dòng)子或其他調(diào)控元件的骨架載體。如果研究啟動(dòng)子強(qiáng)弱或轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的作用，那么就在該螢光素酶的5'端加上待檢測(cè)啟動(dòng)子序列或者有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子（下圖左）。如果想檢測(cè)miRNA對(duì)于目的基因的抑制作用，就可以在螢光素酶3'端加上目的基因的3'UTR（下圖右）。

3'UTR-1.jpg

3'UTR-2.jpg

◆ 內(nèi)參報(bào)告基因載體的選擇

帶有表達(dá)組成型啟動(dòng)子的螢光素酶表達(dá)載體作為內(nèi)參。

不同的載體帶有的啟動(dòng)子不同，通常啟力：CMV＞SV40＞PGK＞TK。通常內(nèi)參基因表達(dá)的活性應(yīng)當(dāng)顯著的高于背景組，同時(shí)，盡量小，確保不干擾主報(bào)告基因的表達(dá)。所以一般選擇內(nèi)參載體時(shí)，首先考慮活性較弱的TK啟動(dòng)子載體，如果表達(dá)量過低，再考慮其他類型的啟動(dòng)子或者構(gòu)建自己需要特殊的啟子。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

◆ 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系選擇

根據(jù)不同細(xì)胞系大小和生長(zhǎng)速度選擇初始密度（混合度在80-90%）。

◆ 轉(zhuǎn)染方法選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。對(duì)于短期表達(dá)的目的基因產(chǎn)物，可以選用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，操作更為簡(jiǎn)便。對(duì)于需要長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的基因產(chǎn)物，建議選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法，穩(wěn)定性更好。

◆ 轉(zhuǎn)染報(bào)告基因比例

主報(bào)告基因：內(nèi)參報(bào)告基因=10:1-100:1。

◆ 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子比例

啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子比例一般為1:9。

◆ 核酸與轉(zhuǎn)染試劑的比例

從1:2開始調(diào)整，另外，注意質(zhì)粒的純度、完整度和去內(nèi)毒素。

報(bào)告基因檢測(cè)

◆ 檢測(cè)試劑選擇

◆ 檢測(cè)板選擇

◆ 檢測(cè)儀器選擇

檢測(cè)儀器：發(fā)光檢測(cè)儀（Luminometer），或帶有發(fā)光檢測(cè)模塊的多功能酶標(biāo)儀。

發(fā)光模式：化學(xué)發(fā)光（Luminescence）。

檢測(cè)類別：終點(diǎn)法檢測(cè)。

波長(zhǎng)范圍：無需設(shè)置波長(zhǎng)，如需選擇，推薦全波長(zhǎng)380-780 nm。
注：只選擇在最大波長(zhǎng)處檢測(cè)發(fā)光，過濾掉其他發(fā)光信號(hào)，意味著檢測(cè)會(huì)丟掉很多信號(hào)，丟失靈敏度。

讀取模式：底讀或頂讀。

檢測(cè)時(shí)間：輝光型0.5-1 sec，閃光型2-10 sec。

數(shù)據(jù)分析

通過儀器可以直接讀出螢火蟲和海腎螢光素酶的數(shù)值，兩種熒光值讀數(shù)不少于4位數(shù)，讀數(shù)大于8位數(shù)時(shí)，需要稀釋裂解上清（讀數(shù)與細(xì)胞種類、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染方法、轉(zhuǎn)染時(shí)間等因素相關(guān)）。

相對(duì)表達(dá)倍數(shù)具體計(jì)算公式如下：

歸一化值=螢火蟲螢光素酶讀值（主報(bào)告基因）/海腎螢光素酶讀值（內(nèi)參基因）

相對(duì)表達(dá)倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組歸一化值/對(duì)照組歸一化值

給大家舉個(gè)例子：

分類	F-Luc	R-Luc	歸一化（F/R)	平均值	相對(duì)表達(dá)倍數(shù)
對(duì)照組1	20118	50201	0.400748989	0.420043613	1
對(duì)照組2	18919	48091	0.393400012
對(duì)照組3	21910	47019	0.465981837
實(shí)驗(yàn)組1	60129	60911	0.987161596	1.226184349	2.919183
實(shí)驗(yàn)組2	87927	56873	1.546023596
實(shí)驗(yàn)組3	78791	68791	1.145367853

通過計(jì)算以上公式計(jì)算，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量是對(duì)照組的2.92倍。

寫到這里，雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)操作篇就給大家分享完了，大家對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)是否有更進(jìn)一步的了解啦！如果您在實(shí)驗(yàn)操作過程中還有其他問題歡迎留言哦~

下期小翌將會(huì)結(jié)合大家的留言進(jìn)一步分享~

最后小翌給大家分享一下Yeasen螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的解決方案，每一步都能幫到您！

相關(guān)產(chǎn)品

類別	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)
螢光素酶報(bào)告基因載體	Luciferase Reporter Plasmid negative control 螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒陰性對(duì)照	11555ES03
	pGM-CMV Luciferase Reporter Plasmid Positive Control pGM-CMV-Luc螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒陽性對(duì)照	11556ES03
	pGMLR-TK Luciferase Reporter Plasmid pGMLR-TK海腎螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒	11557ES03
轉(zhuǎn)染試劑	Hieff Trans™ Liposomal Transfection Reagent 脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑	40802ES02/03/08
血清	Fetal Bovine Serum Origin South America Gold 胎牛血清（南美特級(jí)）	40130ES25/76
支原體檢測(cè)	MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit 一步法快速支原體檢測(cè)試劑盒	40612ES25/60
單/雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑	Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒	11401ES60/76/80
	Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒	11402ES10/60/80
	Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒	11404ES10/60/80
	Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒	11405ES10/60/80