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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：如何正確選擇逆轉(zhuǎn)錄引物？
通過上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：逆轉(zhuǎn)錄酶，你真的了解嗎？》一文的學(xué)習(xí)，相信大家對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶有了一定的了解，但選對(duì)了逆轉(zhuǎn)錄酶并不意味著你的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)就大功告成，逆轉(zhuǎn)錄引物的正確選擇也是重要一環(huán)。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模孓D(zhuǎn)錄引物的選擇也是大相徑庭。接下來，小翌與大家一同學(xué)習(xí)下逆轉(zhuǎn)錄引物的相關(guān)知識(shí)，學(xué)會(huì)如何正確選擇逆轉(zhuǎn)錄引物。
PART 01
逆轉(zhuǎn)錄引物介紹
1
Oligo（dT）
2
隨機(jī)引物
3
基因特異性引物
PART 02
逆轉(zhuǎn)錄引物優(yōu)劣勢(shì)比較
引物類型 | 結(jié)合部位 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
Oligo(dT) | 真核生物mRNA3’端poly(A)尾 | 可合成全長cDNA | 1、僅擴(kuò)增有polyA尾的mRNA 2、對(duì)模板質(zhì)量要求高 |
隨機(jī)引物 | RNA的許多隨機(jī)可結(jié)合部位 | 適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板 | 特異性低，小片段多 |
基因特異性引物 | 特異性互補(bǔ)序列 | 特異性強(qiáng)，靈敏度高 | 僅合成特定的序列 |
PART 03
逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇
RNA類型：
1、真核生物mRNA
2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板
Oligo(dT)
1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以O(shè)ligo(dT)引物結(jié)合
2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結(jié)合
RNA類型：
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板
2、長度比較長、有二級(jí)結(jié)構(gòu)存在及微量樣本的模板
隨機(jī)引物
隨機(jī)引物可以在任意位點(diǎn)和RNA結(jié)合并開始反轉(zhuǎn)
RNA類型：
1、已知基因序列的模板
2、miRNA增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的模板
基因特異性引物
1、針對(duì)特定序列設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物
2、miRNA（莖環(huán)法）的反轉(zhuǎn)錄，需要根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物
【注】:為提高反轉(zhuǎn)錄效率，并保障獲得更加完整的cDNA，建議將Oligo(dT)和隨機(jī)引物混合使用。
PART 04
精品推薦
為方便大家對(duì)逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇，翌圣生物通過基因工程技術(shù)開發(fā)出Hifair® III系列逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，包括兩種引物形式：?jiǎn)为?dú)成管的oligo(dT)、random primer和按比例預(yù)混的oligo(dT)、random primer。其中，按比例預(yù)混的引物僅適用與qPCR實(shí)驗(yàn)中。
RNA類型 | 引物選擇 | 原因 |
1、真核生物mRNA 2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板 | Oligo(dT) | 1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以O(shè)ligo(dT)引物結(jié)合 2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結(jié)合 |
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板 2、長度比較長、有二級(jí)結(jié)構(gòu)存在及微量樣本的模板 | 隨機(jī)引物 | 隨機(jī)引物可以在任意位點(diǎn)和RNA結(jié)合并開始反轉(zhuǎn)。 |
1、已知基因序列的模板 2、miRNA增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的模板 | 基因特異性引物 | 1、針對(duì)特定序列設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物 2、miRNA（莖環(huán)法）的反轉(zhuǎn)錄，需要根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物 |
PART 05
Hifair® Ⅲ 系列逆轉(zhuǎn)錄酶性能展示
可耐受60℃反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄
圖1. 以500 ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板, 使用Hifair® Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat .11139ES) 在42℃-65℃下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取1 μL cDNA為模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat .10148ES)擴(kuò)增TFRC基因（4.4kb）。M:1 kb DNA ladder.
圖2. 以500 ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板，oligo dT為引物，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat .11139ES)合成cDNA。取1 μL cDNA為模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat .10148ES)擴(kuò)增DY1C1N1基因（19.9 kb）5’端的500 bp。M: 1 kb DNA ladder.
線性檢測(cè)范圍廣，Total RNA 10 pg-5 μg
圖3. 以10 pg-5 μg的293T細(xì)胞的總RNA為模板，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)混液 (Cat .11141ES)合成cDNA。取1 μL cDNA為模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 預(yù)混液 (Cat 11195ES)擴(kuò)增PTTG1基因。
PART 06
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) |
單酶 | Hifair®II Reverse Transcriptase | 11110ES92/93 |
高靈敏度單酶 | Hifair® III Reverse Transcriptase | 11111ES92/93 |
Kit | Hifair®II 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11119ES60 |
Kit(含gDNA去除步驟) | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11121ES60 |
高靈敏Kit（含gDNA去除步驟） | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11139ES60 |
預(yù)混液 | Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | 11120ES60 |
預(yù)混液（含gDNA去除步驟） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES60 |
高靈敏預(yù)混液（含gDNA去除步驟） | Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 |
PART 07
翌圣逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品已發(fā)表文獻(xiàn)（部分）
[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3. (IF13.493)
[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotescell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5] Xu L, Xu S, Sun L, et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1). (IF 11.607)
以上是小翌本期給大家分享的內(nèi)容，主要介紹了逆轉(zhuǎn)錄引物的種類、優(yōu)缺點(diǎn)和選擇應(yīng)用。下期，我們將給大家分享逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中的一些注意事項(xiàng)，我們下期不見不散哦~
最后就是小翌發(fā)福利的時(shí)候啦，掃描以下二維碼填寫表單，即可免費(fèi)申請(qǐng)逆轉(zhuǎn)錄系列產(chǎn)品試用裝哦~
一文解鎖RT-qPCR實(shí)驗(yàn)之RNA提取攻略
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干貨分享|一文全面解讀迷之又迷的260/280、260/230
