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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：cDNA的這2個(gè)要素，你注意到了嗎？
通過往期"手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列"文章的綜合學(xué)習(xí)后，相信大家已經(jīng)很熟悉如何將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA了，但獲得的cDNA，大家通?？赡軙?huì)用Nanodrop來測(cè)定其濃度和純度，這樣做真的是正確的嗎？另外，得到的cDNA是否存在基因組DNA（gDNA）污染從而影響后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/span>現(xiàn)在，讓小翌為大家解讀一下。
為什么逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA不需要用Nanodrop來檢測(cè)濃度與純度呢？因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物是一個(gè)混合體系（含有cDNA、未*逆轉(zhuǎn)錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分），會(huì)干擾cDNA的吸光度。此外，260 nm是核酸吸收峰最高的位置，在這個(gè)位置，1 OD（optical density，光密度）的吸光度分別相當(dāng)于50 ng/μL的雙鏈DNA，37 ng/μL的單鏈DNA，40 ng/μL的RNA，30 ng/μL的寡核苷酸（dNTP）。例如，就dNTP而言，即使cDNA濃度一樣，但dNTP也會(huì)嚴(yán)重干擾其測(cè)定結(jié)果。
為此，我們專門進(jìn)行了驗(yàn)證，以進(jìn)一步說明dNTP 投入量對(duì)cDNA濃度檢測(cè)結(jié)果存在的影響。以小鼠肌肉組織RNA為模板，采用Yeasen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒11121ES（dNTP 組分按 1 μL / 1.5 μL /2 μL /2.5 μL添加量的梯度檢測(cè)）、T品牌、V品牌試劑分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，RNA 投入量為500 ng，逆轉(zhuǎn)錄體系及程序分別按各自說明書進(jìn)行。采用Nanodrop測(cè)定cDNA濃度，并取相同體積cDNA分別進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明：
不同品牌逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品的cDNA濃度相差較大，但定量實(shí)驗(yàn)Ct值幾乎一致。
逆轉(zhuǎn)錄體系中dNTP 投入量的多少會(huì)使cDNA濃度的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大差異，但最終Ct值幾乎一致。
表1. Nanodrop定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)表
產(chǎn)品 | 濃度（ng/μl） |
Yeasen 11121ES+ dNTP 1μl | 916.864/920.295 |
Yeasen 11121ES+ dNTP 1.5μl | 1247.707/1235.671 |
Yeasen 11121ES+ dNTP 2μl | 1603.601/1592.303 |
Yeasen 11121ES+ dNTP 2.5μl | 1784.639/1780.047 |
T品牌 | 756.293/759.956 |
V品牌 | 1055.075/1055.137 |
dNTP（10mM）1μl | 9477.6/9488.6 |
圖1.qPCR檢測(cè)結(jié)果△Ct＜1，且 Ct 值與 Nanodrop 定量結(jié)果無(wú)線性關(guān)系
gDNA的污染主要來源于RNA模板， 那如何識(shí)別RNA模板中是否仍含有g(shù)DNA殘留呢？可以在逆轉(zhuǎn)錄之前將RNA模板進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。如下圖所示，泳道上部有明顯的高分子雜帶，則可能有g(shù)DNA的殘留，不建議用于后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性造成影響。
圖2. 高質(zhì)量RNA（左）和RNA中有g(shù)DNA（右）
如果逆轉(zhuǎn)錄前沒有確認(rèn)模板中是否含有g(shù)DNA，可以在qPCR實(shí)驗(yàn)中設(shè)立NRC陰性對(duì)照組（以未逆轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板）驗(yàn)證，如下圖所示，NRC具有明顯的擴(kuò)增，表明RNA中可能含有g(shù)DNA污染。
圖3. qPCR擴(kuò)增曲線圖。NRC：陰性對(duì)照組
是否去除gDNA | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品特點(diǎn) |
是 | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（11121ES） | A.逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃,30 min 總RNA使用范圍：1 ng-5 μg 合成cDNA長(zhǎng)度：10 kb |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)（11123ES） | B.逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃,30 min 總RNA使用范圍:1 ng-5 μg 2×預(yù)混液 | |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)（11139ES） | C.逆轉(zhuǎn)錄條件：55℃,15 min 總RNA使用范圍：10 pg-5 μg 合成cDNA長(zhǎng)度：19.8 kb | |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)（11141ES） | D.逆轉(zhuǎn)錄條件：55℃,15 min 總RNA使用范圍：10 pg-5 μg 4×預(yù)混液，可投入更大體積模板 | |
否 | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（11119ES） | 同A |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（11120ES） | 同B | |
Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（11137ES） | 同D |
Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶性能展示
圖5. 以500 ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板，oligodT為引物，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat#11139ES)合成cDNA。取1 μL cDNA為模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat#10148ES)擴(kuò)增DY1C1N1基因（19.9 kb）的5’的500 bp。M: 1 kb DNA ladder.
出色的逆轉(zhuǎn)錄效率，適合不同 GC 含量、不同表達(dá)豐度的基因
圖6. 以300 ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板, 使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)混液 (Cat#11141ES)、T品牌合成cDNA。取1 μL cDNA為模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 預(yù)混液 (Cat#11195ES)擴(kuò)增20個(gè)不同GC含量（25-65%）、不同表達(dá)豐度的基因。
線性檢測(cè)范圍廣，Total RNA 10 pg-5 μg
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) |
單酶 | Hifair® II Reverse Transcriptase | 11110ES92/93 |
高靈敏度單酶 | Hifair® III Reverse Transcriptase | 11111ES92/93 |
Kit | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11119ES60 |
Kit(含gDNA去除步驟) | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11121ES60 |
高靈敏Kit（含gDNA去除步驟） | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11139ES60 |
預(yù)混液 | Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | 11120ES60 |
預(yù)混液（含gDNA去除步驟） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES60 |
高靈敏預(yù)混液（含gDNA去除步驟） | Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 |
YEASEN逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品部分已發(fā)表文獻(xiàn)(部分)
[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493)
[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5] Xu L , Xu S , Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1).(IF 11.607)
以上是小翌本期給大家分享的內(nèi)容，主要介紹了逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA濃度和純度是否需要用Nanodrop儀測(cè)定和如何判斷cDNA是否存在gDNA污染這兩個(gè)問題。下期，我們將給大家介紹qPCR的背景與原理，我們下期不見不散哦~
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