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提取+建庫(kù)！FFPE樣本文庫(kù)制備一站式解決方案！

2021-11-23　　閱讀(427)

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提取+建庫(kù)！FFPE樣本文庫(kù)制備一站式解決方案！


腫瘤樣本是檢測(cè)基因突變的載體，世界腫瘤發(fā)病率居高不下，而醫(yī)院的低溫儲(chǔ)存設(shè)備捉襟見(jiàn)肘，福爾馬林浸泡，石蠟包埋的樣本（FFPE）能在常溫長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，更受廣大臨床醫(yī)生歡迎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界各地醫(yī)院積攢了約4億FFPE樣本，但是福爾馬林的固定、石蠟高溫浸入、較長(zhǎng)保存時(shí)間都會(huì)導(dǎo)致DNA的交聯(lián)和不同程度降解，如何從這些海量樣本中提取高質(zhì)量DNA，然后建庫(kù)測(cè)序并分析成為了棘手問(wèn)題。翌圣生物深耕生命科學(xué)領(lǐng)域多年，基于自身深厚的工具酶技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)積累，為FFPE DNA的NGS檢測(cè)提供完整解決方案。


圖1.FFPE DNA實(shí)驗(yàn)、分析.jpg

圖1. FFPE DNA實(shí)驗(yàn)、分析


FFPE DNA提取


FFPE DNA提取需經(jīng)歷脫蠟、酶消化、DNA提取共3個(gè)步驟。經(jīng)過(guò)潛心優(yōu)化和精心打磨，翌圣重磅推出FFPE DNA提取試劑盒——MolPure® Magnetic FFPE DNA Kit（鄂漢械備20210919號(hào)）。在FFPE脫蠟步驟中，目前市場(chǎng)上常用的脫蠟方式是二甲苯，其強(qiáng)烈刺激性氣味，強(qiáng)烈刺激人體食道和胃，并引起嘔吐，本試劑盒采用無(wú)毒脫蠟液取代二甲苯脫蠟功效，為實(shí)驗(yàn)人員健康保駕護(hù)航；在酶消化步驟中，翌圣采用精心優(yōu)化提取體系，確保蛋白酶K能充分消化蛋白和相應(yīng)核酸酶，保證DNA釋放和不被核酸酶消化，這一點(diǎn)直接體現(xiàn)在最終DNA產(chǎn)量上面。結(jié)果顯示，翌圣提取總量最高。


圖2. 各試劑盒提取FFPE DNA結(jié)果

在DNA提取步驟中，傳統(tǒng)的手段有酚氯仿抽提、柱膜法、磁珠法，基于未來(lái)大樣本量自動(dòng)化應(yīng)用場(chǎng)景考量，翌圣采用磁珠混合液，操作簡(jiǎn)便，保證提取DNA純度，且兼容自動(dòng)化核酸提取儀，大幅提升大樣本量FFPE DNA提取效率。


FFPE DNA文庫(kù)構(gòu)建



 1   酶切法建庫(kù)

FFPE DNA一般需要打斷才能建庫(kù)，和機(jī)械法打斷相比，酶切法更溫和更高效，對(duì)片段損傷更小，且不需要專(zhuān)門(mén)打斷儀器和耗材，降低了實(shí)驗(yàn)成本。針對(duì)不同測(cè)序平臺(tái)，翌圣均布局了酶切建庫(kù)解決方案，助力客戶(hù)簡(jiǎn)單高效進(jìn)行建庫(kù)實(shí)驗(yàn)。針對(duì)Illumina平臺(tái)，翌圣推出Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina®，采用最新優(yōu)化的連接酶、最新型高保真酶，改善接頭連接時(shí)的片段自連并進(jìn)一步提升擴(kuò)增的均一性和保真性，持續(xù)提升測(cè)序結(jié)果質(zhì)量。針對(duì)日益普及的MGI平臺(tái)，翌圣推出Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI®（酶切法），滿(mǎn)足客戶(hù)對(duì)不同測(cè)序平臺(tái)建庫(kù)需求。

33333333.jpg

圖3. 文庫(kù)產(chǎn)出（50ng FFPE DNA）

 圖4 文庫(kù)測(cè)序下機(jī)結(jié)果.jpg

圖4.文庫(kù)測(cè)序下機(jī)結(jié)果


 2   建庫(kù)接頭

建庫(kù)完成后的混樣測(cè)序中，index（或稱(chēng)barcode）是區(qū)分各個(gè)樣本的，通常只有幾個(gè)堿基差異，而實(shí)驗(yàn)操作引入的index污染、PCR擴(kuò)增誤差、測(cè)序擴(kuò)增誤差均造成標(biāo)簽跳躍 (index hopping)，單端index長(zhǎng)接頭、雙端組合接頭CDI(Combinational Dual Index)在區(qū)分測(cè)序樣本來(lái)源能力較為薄弱。針對(duì)這個(gè)測(cè)序中頻發(fā)的難題，在illumina和MGI測(cè)序平臺(tái)，翌圣均布局雙端特異性接頭UDI（Unique Dual Index）產(chǎn)品，例如，Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®雙端特異性接頭多達(dá)384種，*檢測(cè)需求。結(jié)合文庫(kù)QC，保證低污染的文庫(kù)進(jìn)行混樣和測(cè)序，將大幅降低index hopping帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)困擾，助您實(shí)驗(yàn)無(wú)憂(yōu)。

圖5. UDI識(shí)別index hopping的原理


 3   DNA磁珠

磁珠純化是建庫(kù)關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，Hieff NGS® DNA Selection Beads基于SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization)原理，通過(guò)精心優(yōu)化過(guò)的緩沖體系，可用于DNA文庫(kù)片段分選、純化，和目前廣泛使用的AMPure XP Beads使用方式相同，片段回收效率和文庫(kù)大小分布均高度吻合，因此可無(wú)縫替代AMPure XP Beads，有效降低建庫(kù)成本。

表1.不同品牌磁珠在不同比例下回收效率比較

磁珠比例

Input DNA (ng)

Yeasen

Be*

Va*

Vd*

Tr*

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

1.8×

535

534.4

99.89%

524.8

98.09%

518.4

96.90%

566.4

105.87%*

534.4

99.89%

1.2×

518.4

96.90%

537.6

100.49%*

521.6

97.50%

528

98.69%

505.6

94.50%

0.8×

499.2

93.31%

406.4

75.96%

416

77.76%

464

86.73%

425.6

79.55%

0.6×

326.4

61.01%

210.56

39.36%

281.6

52.64%

283.52

52.99%

247.04

46.18%

【注】：DNA Marker中含loading等物質(zhì)，影響核酸定量，因而初始的Input定量結(jié)果偏低，所以表中出現(xiàn)回收效率略高于100%。


 4   文庫(kù)定量

核酸定量在NGS實(shí)驗(yàn)流程很常見(jiàn)。Qubit常用于提取DNA和文庫(kù)初步定量，翌圣推出dsDNA HS Assay Kit for Qubit®，可實(shí)現(xiàn)0.2-100 ng雙鏈DNA（dsDNA）快速、精確的定量，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，同時(shí)為了進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)便捷性，亦可提供預(yù)混液版本定量試劑；此外因?yàn)槲膸?kù)純化后可能存在一定接頭互聯(lián)、為連接接頭的雙鏈DNA，若采用Qubit定量文庫(kù)可能會(huì)虛高，所以針對(duì)文庫(kù)精準(zhǔn)定量，翌圣推出Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®，擴(kuò)增引物對(duì)根據(jù)Illumina文庫(kù)接頭序列P5和P7設(shè)計(jì)，可保證特異性擴(kuò)增雙端接頭完整的文庫(kù)分子，從而實(shí)現(xiàn)Illumina文庫(kù)精準(zhǔn)定量。

穩(wěn)定性檢測(cè).jpg

精準(zhǔn)度分析.jpg

圖6.Qubit定量穩(wěn)定性與精確性對(duì)比 

隨著國(guó)內(nèi)基于NGS技術(shù)的基因測(cè)序市場(chǎng)的持續(xù)發(fā)展，翌圣生物將會(huì)根據(jù)客戶(hù)需求推出基于NGS檢測(cè)的全流程解決方案，加速推進(jìn)國(guó)產(chǎn)試劑的替換進(jìn)程，幫助客戶(hù)創(chuàng)造價(jià)值，讓世界更健康更快樂(lè)。


訂購(gòu)信息



產(chǎn)品名稱(chēng)

產(chǎn)品編號(hào)

規(guī)格

MolPure® Magnetic FFPE DNA Kit  磁珠法FFPE DNA提取試劑盒

18371ES50

50T

Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina® DNA 酶切法建庫(kù)試劑盒

12205ES24

12205ES96

24T

96T

Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for MGI® DNA 酶切法建庫(kù)試劑盒

13322ES16

13322ES96

16T

96T

Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®  UDI接頭

12404ES01

12405ES01

12406ES01

12407ES01

12×2T

96×2T

192×1T

384×1 T

Hieff NGS® Unique Dual Index Primer Kit for MGI® Set 1

13451ES02

13451ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS® Unique Dual Index Primer Kit for MGI® Set 2

13452ES02

13452ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS® Unique Dual Index Primer Kit for MGI® Set 3

13453ES02

13453ES04

 

 

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS® Unique Dual Index Primer Kit for MGI® Set 4

13454ES02

13454ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS® DNA Selection Beads 分選磁珠

12601ES08

12601ES56

12601ES75

5mL

60mL

450mL

dsDNA HS Assay Kit for Qubit®  Qubit試劑

12640ES60

12640ES76

100T

500T

1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®  Qubit預(yù)混液

12642ES60

12642ES76

100T

500T

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix，qPCR文庫(kù)定量

12302ES05

500T

Hieff NGS® Library dilution buffer 文庫(kù)稀釋液 

12303ES50

50 mL

Hieff NGS®Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard 1-6  qPCR標(biāo)準(zhǔn)品

12307ES09

6×96μL




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