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核酸提取總是出問(wèn)題？別怕，答案在這
核酸作為一切分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，其提取通常是開(kāi)啟生物學(xué)研究的第一步，而且提取的核酸質(zhì)量高低也是決定下游實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一。
圖片來(lái)源：pixabay
小翌總結(jié)一些現(xiàn)用核酸提取過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題。
1.A260/280比值較低？或者A260/280比值較高？
2.提取的細(xì)菌基因組DNA有降解，為什么？
確認(rèn)選用的培養(yǎng)菌體是否新鮮，如果菌體需要保存時(shí)，請(qǐng)于-80℃保存。
起始菌液量過(guò)多，導(dǎo)致菌液裂解不充分，部分DNA降解。
菌體本身富含DNA酶活性，加入Digestion solution后再加20uL0.5M EDTA溶液來(lái)抑制內(nèi)源性核酸酶
3.提取的基因組DNA生物活性差，為什么？
提取的基因組DNA中鹽分濃度過(guò)高，請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。
提取的基因組DNA中含有乙醇。離心的速度和時(shí)間應(yīng)該嚴(yán)格遵循說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。
4.堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，看到的三條帶分別是什么？
堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線(xiàn)性DNA，得到的三條帶是以電泳速度的快慢排序的，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制*的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過(guò)度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。
5. 為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊醇？
在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊醇為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24：1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。
1.凍存細(xì)胞與新鮮細(xì)胞的RNA提取有區(qū)別嗎？具體該怎么操作？
2.RNA得率低
該組織或者細(xì)胞中RNA含量偏低：不同細(xì)胞和組織中RNA的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟等是高豐度組織(總RNA含量2-4μg/mg)，腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢等是中豐度組織(總RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低豐度組織(總RNA含量<0.05μg/mg)。
組織起始量太少或者太多：樣品量過(guò)少，則細(xì)胞組織中RNA含量較低；樣品量過(guò)多則可能超過(guò)裂解液的裂解能力，裂解將不*，從而導(dǎo)致RNA得率低。
提取的材料不新鮮。新鮮組織取得后應(yīng)立即置于液氮中或立即放入RNAstore試劑中，以保證提取效果。
處理樣品量過(guò)大。
污染了RNase。雖然試劑盒中提供的緩沖液都不含RNase，但使用過(guò)程中很容易污染RNase，應(yīng)小心操作。
4.OD260/OD280比值偏低
蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量，確保裂解*、*。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。
多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會(huì)導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類(lèi)材料中提取RNA時(shí)，需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。
設(shè)備限制：測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線(xiàn)性最好。用水稀釋樣品：測(cè)OD值時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用10mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。
5.RNA 中有基因組DNA污染
材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽。
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
材料過(guò)量：增加試劑用量。
RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高。
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
本次的分享就到這里，如果大家在核酸提取過(guò)程中遇到問(wèn)題，歡迎到文章底部留言哦，專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員會(huì)解答您的疑問(wèn)。
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