初級(jí)會(huì)員·13年聯(lián)系電話
肝臟是人體中最大的器官之一，來(lái)源于內(nèi)胚層中前腸上皮細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的肝芽結(jié)構(gòu)，以代謝功能為主，發(fā)揮“解毒"作用。肝功能失衡會(huì)導(dǎo)致稱為肝衰竭的病理狀況，并導(dǎo)致肝炎、纖維化、肝硬化、癌癥、代謝或自身免疫性疾病。因此，為充分了解每種肝病的表型和損傷器官的機(jī)制，我們需要體外個(gè)性化肝模型系統(tǒng)進(jìn)行疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和藥物毒性學(xué)習(xí)。
肝臟類器官(hepatic organoids, HLO, HO)是肝臟功能的3D模型，保留了肝細(xì)胞的主要生理特征。在存在或不存在基質(zhì)的情況下，可以從iPSC、ESC或特定的成體細(xì)胞（例如上皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞）生成類器官。
我們根據(jù)JCI Insight[1]、Cell Metab[2]和J Hepatol[3]發(fā)表的三篇文章，整理了由人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human iPSCs)生成肝臟類器官的培養(yǎng)方案。
圖1.iPSC分化為肝類器官的過(guò)程(PMID: 28878125)[1]
A：iPSC分化為肝類器官的示意圖；B-C：在第0天(iPSCs)、第3天（定形內(nèi)胚層，EN）、第6天（前腸，F(xiàn)G）、第9天（成肝細(xì)胞，HB)、第20天(HO1)和第62天(HO2)在HO發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞標(biāo)記變化。
iPSC在含有5 mM EDTA和10 mM Y-27632的緩沖液解離為單個(gè)細(xì)胞，接種到低吸附的6孔板上，然后用含有激活素A (100 ng/mL)和BMP4 (10 ng/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3天；
更換為含有2% Matrigel和B27的RPMI培養(yǎng)基；第3 -6天，培養(yǎng)基中加入50 ng/mL FGF10；第6-9天，培養(yǎng)基中加入10 ng/mL FGF10和10 ng/mL BMP4；
第9天后，更換為含有1% Matrigel、50 ng/mL HGF、50 ng/mL oncostatin M和10 μM Dexamethasone的類器官生長(zhǎng)和分化培養(yǎng)基(HCM)中。
圖2.iPSC分化為肝類器官的過(guò)程(PMID: 31155493)[2]
A：iPSC分化為肝類器官的示意圖；B：在第0天(iPSCs)和第20天(HLO)明場(chǎng)圖像。
在第20天收集培養(yǎng)物，將細(xì)胞解離，200 g離心3 min收集細(xì)胞，重懸于50 μL GFR-Matrigel中，接種到24孔板中。Matrigel凝固后，加入1 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基(RPMI-1640, B27, 250 nM LDN-193189, 3 μM CHIR99021, 10 μM A83-01, 100 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF10和20 ng/mL HGF)，培養(yǎng)細(xì)胞6天，更換為分化培養(yǎng)基(HCM medium, 10 μM DAPT, 10 ng/mL oncostatin M, 20 ng/mL HGF, 10 μM Dexamethasone, 10 ng/mL BMP4)再培養(yǎng)6天。
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | 簡(jiǎn)介 |
Y-27632 | 53006ES | 1 mg/5 mg/10 mg | ROCK抑制劑 |
CHIR99021 | 53003ES | 2 mg/5 mg/10 mg | GSK-3α/β抑制劑 |
Dexamethasone 地塞米松 | 53269ES | 250 mg/500 mg/1 g | 糖皮質(zhì)激素受體激動(dòng)劑 |
LDN193189 | 53012ES | 5 mg/10 mg | BMP信號(hào)通路抑制劑 |
A 83-01 | 53002ES | 1 mg/5 mg/10 mg | TGF-β信號(hào)抑制劑 |
DAPT | 52104ES | 10 mg/50 mg | Notch通路抑制劑 |
human BMP4 | 92053ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human EGF | 92708ES | 100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human Activin A | 91702ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF4 | 91303ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF10 | 91306ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human HGF | 92055ES | 10 μg/50 μg/1 mg | 重組蛋白 |
human oncostatin M | 92254ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
N-2 supplement,serum free,100X | 60706ES | 5 mL | 用于細(xì)胞和組織體外培養(yǎng) |
HEPES溶液(1 M)，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí) | 60117ES | 100 mL | 化學(xué)緩沖劑 |
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 | 60370ES | 10 g/100 g | 抗氧化 |
BSA牛血清白蛋白,診斷級(jí)別 | 36102ES | 25 g/100 g/500 g/1 kg | 用于細(xì)胞培養(yǎng) |
50× B-27無(wú)血清添加劑，去除維生素A | 60704ES | 10 mL | 無(wú)血清添加劑 |
[1] Guan Y, et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight
. 2017 Sep 7;2(17):e94954.
[2] Ouchi R, et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metab. 2019 Aug 6;30(2):374-384.e6.
[3] Mun SJ, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. J Hepatol. 2019 Nov;71(5):970-985.
