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在病變的晚期會大面積感染肺組織，可能會對肺功能造成嚴(yán)重的損害。在過去三年中，人類干細(xì)胞衍生的類器官已經(jīng)成為了新冠研究的有利工具。
人肺類器官(human lung organoid, hLOs)擁有類似支氣管和肺泡的結(jié)構(gòu)，與人肺部組織結(jié)構(gòu)功能相似，培養(yǎng)過程復(fù)雜。研究人員利用小分子化合物和細(xì)胞因子誘導(dǎo)干細(xì)胞生成了內(nèi)胚層，再讓內(nèi)胚層形成三維組織，得到了類似胚胎中早期肺的組織，進(jìn)一步使其發(fā)育成為肺部組織。
人肺類器官培養(yǎng)方案有很多種，接下來，我們根據(jù)Han和Alyssa J Miller等文章總結(jié)了人類多能干細(xì)胞(hPSC)形成人肺類器官和芽尖祖細(xì)胞類器官的大致過程[1][2]。
圖1 Alyssa J Miller等的hPSC形成人肺類器官和芽尖祖細(xì)胞類器官的過程[2]
培養(yǎng)方案
01
hPSC定向分化為內(nèi)胚層
hPSCs用Accutase (40506ES)處理并接種到低吸附的6孔板上，重懸于含有10 μM Y-27632 (53006ES)、0.5 ng/mL human BMP4 (92053ES)、2.5 ng/mLhuman bFGF (91330ES)、100 ng/mL human Activin A (91702ES)的無血清分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天。
02
誘導(dǎo)形成前腸球體
為誘導(dǎo)前腸球體，更換培養(yǎng)基為前腸分化培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、10 mM HEPES (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、10 µM SB431542 (53004ES)、200 ng/mL human Noggin (92528ES)、1 µM SAG(53257ES)、500 ng/mL human FGF4 (91303ES)和2 µM CHIR99021 (53003ES)，培養(yǎng)5天。
然后在不破壞單層細(xì)胞的情況下收集漂浮的球體，離心后轉(zhuǎn)移至新的離心管中，接種至含有Matrigel膠的平板中，37°C靜置。
圖2 前腸球體的明場圖片[2]
03
誘導(dǎo)人肺類器官和芽尖祖類細(xì)胞器官
3.1 誘導(dǎo)人肺類器官
向前腸球體中加入人肺類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、1% FBS、10 mM HEPES (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、500 ng/mL human FGF10(91306ES)進(jìn)行培養(yǎng)，每兩周換液。
大約需要50天可以產(chǎn)生人肺類器官，并且具有氣道樣上皮細(xì)胞，周圍環(huán)繞著間充質(zhì)細(xì)胞和表達(dá)肺泡細(xì)胞型標(biāo)記物的上皮細(xì)胞的彌散網(wǎng)絡(luò)。
圖3 人肺類器官預(yù)期生長模式的明場圖像[2]
3.2 誘導(dǎo)芽尖祖細(xì)胞類器官
向前腸球體中加入人肺類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、10 mM HEPES (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、10 ng/mL humanFGF7 (91304ES)、0.5% BSA (36102ES)、50 µg/mL抗壞血酸(53614ES)、3 µM CHIR99021 (53003ES)、50 nM ATRA(53001ES)和0.4 µM monothio-glycerol，進(jìn)行培養(yǎng)，每2-3天換液，會生成芽尖祖細(xì)胞類器官。
培養(yǎng)22天后，芽尖祖細(xì)胞類器官含有高度富集和增殖的、轉(zhuǎn)錄類似于人類胎兒芽尖祖細(xì)胞的SOX2+ - SOX9+ ID2+ NKX2.1+種群細(xì)胞。
圖4 芽尖祖細(xì)胞類器官生長模式的明場圖像[2]
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 簡介 |
Y-27632 | 53006ES | 1 mg/5 mg/10 mg | ROCK抑制劑 |
SB431542 | 53004ES | 5 mg/10 mg/50 mg | Src家族激酶抑制劑，TGF-β信號通路抑制劑 |
CHIR99021 | 53003ES | 2 mg/5 mg/10 mg | GSK-3α/β抑制劑 |
Smoothened Agonist (SAG) | 53257ES | 2 mg/5 mg/10 mg | Smo受體激動劑 |
L-Ascorbic acid L-抗壞血酸 | 53614ES | 1 g/5 g | 維生素C，抗氧化劑 |
Retinoic acid（維甲酸，維A酸） | 53001ES | 100 mg/500 mg/1 g | 誘導(dǎo)細(xì)胞分化 |
Accutase™ 細(xì)胞消化液 | 40506ES | 100 mL | 細(xì)胞消化液 |
human BMP4 | 92053ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human bFGF | 91330ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human Activin A | 91702ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human Noggin | 92528ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF4 | 91303ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF10 | 91306ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF7 | 91304ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
N-2 supplement,serum free,100X | 60706ES | 5 mL | 用于細(xì)胞和組織體外培養(yǎng) |
HEPES溶液(1 M)，細(xì)胞培養(yǎng)級 | 60117ES | 100 mL | 化學(xué)緩沖劑 |
L-谷氨酰胺 | 60314ES | 100 g | 氨基酸 |
BSA牛血清白蛋白,診斷級別 | 36102ES | 25 g/100 g/500 g/1 kg | 用于細(xì)胞培養(yǎng) |
50× B-27無血清添加劑，去除維生素A | 60704ES | 10 mL | 無血清添加劑 |
參考文獻(xiàn)
[1] Han Y, et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 2021 Jan;589(7841):270-275.
[2] Miller AJ, et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 2019 Feb;14(2):518-540.
