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酶聯(lián)免疫吸附測定，又稱酶聯(lián)免疫吸附試驗，即ELISA，是酶免疫測定技術(shù)中應用的技術(shù)。1971年Engvall等人發(fā)表了使用ELISA定量測定IgG的文章，將1966年用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法。
ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合，檢測過程中，通常使用洗板的方式去除非結(jié)合物，最終酶促反應后的底物的顏色，對樣本中蛋白進行定性與定量。
1.抗體：單抗特異性強，多抗結(jié)合性高，試劑盒需要高效的配對。
2.抗原：大多為重組蛋白,細胞因子和待測樣本，高效標準品需NIBSC/WHO校準。
3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強度熒光。
圖1：ELISA常用試劑示意圖
根據(jù)試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法，按照原理及操作，市面的方法有：
是檢測抗體的方法，原理為利用酶標記的二抗以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，顯色測定。優(yōu)勢在于待測一抗無需標記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似，區(qū)別在于一抗酶標，檢測孵育也以抗原為主，但直接法ELISA的靈敏度有限，需權(quán)衡使用。
圖2：間接法ELISA示意圖
又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA，原理相似，用于檢測抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例，捕獲抗體包被在固相載體上，加入抗原或待測樣本結(jié)合，后加入的檢測抗體結(jié)合在抗原上，形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。
圖3：雙抗夾心法ELISA示意圖
小分子抗原與半抗原的檢測方法常用競爭法ELISA，待檢樣本中抗原越多，被結(jié)合的酶標抗原的量會減少，彼此形成競爭負相關(guān)體系，顯色物質(zhì)也就越少，根據(jù)顯色物質(zhì)的比例可擬合得到待測抗原含量。
圖4：競爭法ELISA示意圖
a.免疫抑制法測ELISA：固相包被抗原，被檢樣本對底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比，二者之差為待測抗原含量，原理類似與競爭法ELISA。
b.阻斷ELISA：目的檢測特異性抗體，也稱為競爭ELISA，原理為固相包被抗原，待測樣本與一抗酶標競爭孵育，待檢樣本中抗體越多，顯色越淺，反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中涉及該法。
c.此外有用于檢測IgM抗體的抗體捕捉ELISA，有固相載體改變的Dot-ELISA（硝酸纖維素膜）和C-ELISA（滌綸布），還有技術(shù)分類的TRFIA和多因子檢測等。
ELISA Kit的多指標決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：
ELISA Kit的多指標決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：
a.回收率：測定試劑盒對數(shù)據(jù)真實性的校準，過高或偏低會產(chǎn)生加樣和假性性的失準數(shù)據(jù)。
b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準確性，過高或偏低均會出現(xiàn)測定的偏差。
a.板內(nèi)精確度：評價單次實驗中，同一個已知濃度不同復孔的差異。
b.板間精確度：評價同一樣本，多次實驗的差異。
低檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應的低濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。
a.交叉反應：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力，交叉反應越大，特異性越差。
b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質(zhì)對檢測系統(tǒng)的干擾。
對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結(jié)果。
試劑盒時效性和穩(wěn)定性是對指標檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲時間越久。
圖5：ELISA試劑盒產(chǎn)品分類
ELISA技術(shù)是特定靶標蛋白質(zhì)定量的金標準，提供快速，穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果?？梢詫ι锎蠓肿?小分子的定量，對親和力測定評價或者篩選，還可對重組蛋白或細胞因子進行活性比對分析等運用。常應用于細胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時應用于癌癥、干細胞、免疫學、神經(jīng)學和信號轉(zhuǎn)導等研究領(lǐng)域的靶標。
圖6：ELISA的技術(shù)應用
在生物醫(yī)藥研究，細菌疾病和臨床診斷中，ELISA作為成熟免疫的檢測方法定量檢測出所需研究的細胞因子，抗原等物質(zhì)，應用十分廣泛，了解ELISA并選擇合適的試劑盒，會讓研究事半功倍。
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