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上期，我們介紹了酶定向進(jìn)化的突變體文庫構(gòu)建技術(shù)（點(diǎn)擊查看詳情）。高質(zhì)量的突變體文庫是定向進(jìn)化的基礎(chǔ)，與之相匹配的是高效、靈敏的突變體篩選技術(shù)手段。根據(jù)突變體酶參與反應(yīng)的場所來區(qū)分，篩選技術(shù)可分為體內(nèi)和體外篩選，篩選的通量和準(zhǔn)確度正隨著技術(shù)的不斷升級而提升。
體內(nèi)篩選是由菌株篩選衍生而來，目標(biāo)酶活性與菌株生長、環(huán)境中底物代謝程度相關(guān)，性能缺陷的酶不足以支撐宿主形成單克隆，或無法使底物發(fā)生顯著變化。該方法適用于篩選與細(xì)菌生長、抗生素耐受等關(guān)鍵代謝途徑相關(guān)的酶，或可使底物發(fā)生顯著顏色變化的蛋白。不過，由于微生物可調(diào)整自身代謝流以適應(yīng)環(huán)境，且存在多種補(bǔ)償途徑，菌株表現(xiàn)的優(yōu)勢可能并非僅僅是目標(biāo)酶的貢獻(xiàn)。
2011年，David Liu團(tuán)隊(duì)開發(fā)了PACE系統(tǒng)（噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化，Phage-assisted continuous evolution）用于T7 RNA聚合酶的馴化。PACE以M13絲狀噬菌體為載體，將目標(biāo)酶的活性與子代噬菌體的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。其設(shè)計(jì)原理如圖1b所示，T7 RNA聚合酶基因取代了噬菌體的衣殼蛋白基因gIII，并受gIII的啟動(dòng)子控制，gIII基因則安裝在輔助質(zhì)粒上，受T7啟動(dòng)子控制。重組噬菌體侵染宿主后gIII啟動(dòng)子開放，T7 RNA聚合酶水平上升，進(jìn)而介導(dǎo)GIII蛋白大量表達(dá)，T7 RNA聚合酶基因被包裝在子代噬菌體內(nèi)。聚合酶活性越高，產(chǎn)生的活性子代噬菌體顆粒越多，相應(yīng)突變體序列便隨代次增加而逐漸富集。不僅如此，PACE系統(tǒng)還包含了誘變質(zhì)粒MP（Mutagenesis plasmid），多個(gè)誘變基因在L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下，介導(dǎo)包含目的基因在內(nèi)的全基因組范圍的堿基突變。在連續(xù)流加培養(yǎng)體系中，基因組上積累了突變的大腸桿菌不斷被新鮮的細(xì)胞稀釋取代，用來給子代噬菌體提供優(yōu)質(zhì)的宿主，而攜帶突變的噬菌體持續(xù)侵染并疊加新的突變，實(shí)現(xiàn)目的基因的連續(xù)篩選和進(jìn)化（圖1a）。利用PACE系統(tǒng)，項(xiàng)目組成功地馴化了可以識別T3啟動(dòng)子的T7 RNA聚合酶突變體。
圖1. PACE進(jìn)化系統(tǒng)
（圖片源自：doi: 10.1038/s41596-020-00410-3.）
PACE系統(tǒng)憑借快速、自動(dòng)化的優(yōu)勢被迅速推廣，適用于RNA聚合酶、蛋白酶、tRNA合成酶等酶的進(jìn)化，以及一些與DNA、蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的篩選（圖1c）。同時(shí)，在GIII的拮抗蛋白GIII-neg的輔助下，PACE系統(tǒng)可以更靈活地用于提升多種酶的不同性能（圖1d）。盡管如此，那些無法關(guān)聯(lián)到gIII或其他噬菌體基因表達(dá)過程的蛋白依然難以用PACE系統(tǒng)進(jìn)行篩選，并且所有會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌生長異常的選擇壓力都難以應(yīng)用。
圖2. HaeIII甲基轉(zhuǎn)移酶的篩選
（圖片源自：doi: org/10.1038/nbt0798-652.）
圖3. 分隔自復(fù)制系統(tǒng)
（圖片源自：doi: 10.1073/pnas.071052198.）
以流式分選技術(shù)為例，只要酶性能與細(xì)胞的大小、形狀、熒光強(qiáng)度或表面修飾狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)監(jiān)測口時(shí)儀器就能采集相關(guān)信號并借助電荷和磁場的作用，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的分選。而適用于微米級微生物分選的FADS（Fluorescence-Activated Droplet Sorting）及其衍生系統(tǒng)（AADS、BADS、MADS）則是另一種技術(shù)，為流式分選和液滴技術(shù)的結(jié)合。微生物細(xì)胞和底物分散在反應(yīng)緩沖液中作為水相流入PDMS芯片中，油相則從垂直方向進(jìn)入，通過調(diào)整兩種液體的流速，水相被均勻地分割為20-50 μm大小的液滴。不同于耐熱的CSR體系，液滴分選系統(tǒng)的細(xì)胞破碎只能依賴溶菌酶或其他化學(xué)試劑。為了防止細(xì)胞在進(jìn)入液滴前裂解，溶菌試劑推薦使用再注入的方法輸入液滴，或使用替代方案先將溶菌組分與細(xì)胞混合，再將反應(yīng)底物注入液滴。隨后液滴在合適條件下脫機(jī)孵育，催化反應(yīng)將使液滴內(nèi)的濁度、pH值、熒光信號強(qiáng)度、特征化合物的量發(fā)生顯著變化，超過設(shè)定閾值的液滴將在電場或氣流的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，流入收集管內(nèi)（圖4）。收集的完整細(xì)胞可直接涂布培養(yǎng)，破碎的細(xì)胞則只能擴(kuò)增回收DNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖4. 液滴分選
（圖片源自：doi: 10.1016/j.tibs.2021.11.001.）
液滴分選系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢：直接檢測產(chǎn)物，可準(zhǔn)確反應(yīng)酶學(xué)性能的變化；皮升級的液滴反應(yīng)器可大幅度節(jié)約試劑成本（~10^6倍）；最多可實(shí)現(xiàn)10^8/day的液滴分選；可通過設(shè)計(jì)芯片結(jié)構(gòu)、調(diào)整模塊組合來適配多種酶的篩選場景。
針對以上介紹的不同突變體文庫篩選方法總結(jié)如下表，實(shí)際可根據(jù)不同需求選擇。
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