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雜交捕獲家族“核心成員"大揭秘！
近年來，高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，測序成本也在逐漸降低。但就現(xiàn)階段而言，全基因組測序的成本依然很高，且測序之后得到的龐大數(shù)據(jù)量也導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析速度緩慢。與全基因組測序相比，靶向捕獲測序可以針對感興趣的區(qū)域進(jìn)行富集，單個樣本所需測序數(shù)據(jù)量顯著降低且分析速度更快。不僅如此，靶向測序還可以對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行深度測序，在遺傳突變檢測、腫瘤篩查等領(lǐng)域，相同測序成本下靶向捕獲測序能達(dá)到更高的靈敏度。
圖1 .3種測序方法簡單對比
靶向捕獲包含雜交捕獲、多重PCR和分子倒置探針捕獲。和PCR以及分子倒置探針捕獲（MIP）方法相比，雜交捕獲具有捕獲區(qū)段大（可達(dá)幾百M(fèi)B）和探針均一性好的優(yōu)勢。
均一性是評價捕獲技術(shù)很關(guān)鍵的參數(shù)，均一性好后續(xù)測序成本就會下降。缺點(diǎn)是容易捕獲非目標(biāo)片段，造成成本增加。因?yàn)殡s交前樣本會被隨機(jī)打斷到比較合適的長度，探針捕獲時可能和目標(biāo)片段部分雜交，導(dǎo)致一些含有部分目標(biāo)區(qū)段的文庫被捕獲。所以雜交捕獲的特異性較差，容易捕獲非目標(biāo)區(qū)段。
圖2.靶向捕獲技術(shù)優(yōu)劣勢對比圖
根據(jù)探針的狀態(tài)和雜交狀況不同雜交捕獲分為固態(tài)雜交和液態(tài)雜交。固相雜交捕獲法是先選定目標(biāo)DNA區(qū)域，在芯片上修飾與目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的探針，隨后在芯片上進(jìn)行DNA與探針的雜交反應(yīng)，最后將與探針雜交的DNA洗脫下來用于后續(xù)的測序工作。液相雜交捕獲技術(shù)是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對原理，在溶液中生物素標(biāo)記的探針與靶區(qū)域特異性結(jié)合，通過鏈霉親和素磁珠對探針捕獲到的目的片段進(jìn)行富集的技術(shù)。
固相雜交由于其在花費(fèi)與操作上的劣勢，已基本被淘汰，液相雜交捕獲法是目前被廣泛應(yīng)用的靶向測序方法，具有探針設(shè)計難度低、探針容錯性高等優(yōu)點(diǎn)。
圖3 .固（左）/液（右）相雜交捕獲原理圖
在液相捕獲過程中，還有2個的角色接頭序列封阻劑（Universal Blocker）和重復(fù)序列封阻劑（Cot-1 DNA）。其中，Universal Blocker含有修飾堿基，可針對不同的index序列進(jìn)行封閉；Cot-1 DNA來源于人胎盤中提取的基因組DNA，為人基因組中長約50至300 bp的高度重復(fù)序列，能夠方便、有效地對待檢測樣品核酸序列中的重復(fù)序列進(jìn)行封閉，屏蔽重復(fù)序列，從而避免核酸雜交過程中非特異性信號的干擾。兩種封阻劑共同作用，最終實(shí)現(xiàn)對待檢測核酸樣本中核酸序列的有效捕獲。
圖4.2種封閉試劑的作用原理
Cot-1最早是在核酸雜交實(shí)驗(yàn)中，用來避免探針的非特異性結(jié)合所導(dǎo)致的背景噪音。具體到液相雜交捕獲實(shí)驗(yàn)中，探針雖然是人為設(shè)計的序列，可以避免探針和高拷貝/重復(fù)性序列的結(jié)合，但當(dāng)Cot-1不足時，探針和文庫還是會產(chǎn)生一定數(shù)量的氫鍵而實(shí)現(xiàn)非特異性地結(jié)合，即使這種結(jié)合并不非常充分，或者只有部分區(qū)域的結(jié)合，但這種結(jié)合會導(dǎo)致捕獲特異性顯著下降。
Universal Blocker的作用相對明確，就是阻止不同文庫分子通過adapter之間的互補(bǔ)序列產(chǎn)生結(jié)合。
圖5.Cot-1和Blocker不足時非特異結(jié)合示意圖
翌圣全外顯子捕獲產(chǎn)品，包含全外探針、雜交清洗試劑盒、Blocking Oligo、Post-PCR Primer和鏈霉親和素磁珠，在遺傳突變檢測、腫瘤篩查等領(lǐng)域為您提供目標(biāo)區(qū)域更加明確，覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，也更加經(jīng)濟(jì)的全套捕獲解決方案！
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品應(yīng)用 |
Hieff NGS® Human All Exon Probes | 12244ES | 人全外顯子探針 |
Hieff NGS® Hyb & Wash Kit | 12245ES | 雜交清洗試劑 |
Hieff NGS® Universal Blocking Oligo (with cot-1) | 12246ES | 接頭封阻劑 |
Hieff NGS® Universal Post PCR Primer for Illumina | 12247ES | 擴(kuò)增引物 |
Hieff NGS® Hyper Enrichment Beads | 12248ES | 捕獲磁珠 |
