聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會(huì)員·13年
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機(jī)：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓
- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源。
*1 OLIGO Primer Analysis Software
非特異性產(chǎn)物本身會(huì)和SYBR 染料結(jié)合導(dǎo)致熒光產(chǎn)生，從而人為地改變反應(yīng)的Ct值。非特異性擴(kuò)增可以通過競爭反應(yīng)組分來影響反應(yīng)效率，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性降低。引物二聚體是一類常見的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。引物二聚體通常是由正向和反向引物之間的相互作用引起的，但也可能是正向-正向或反向-反向引物退火的結(jié)果，或者單個(gè)引物自行折疊的結(jié)果。如果二聚化以交錯(cuò)的方式發(fā)生作用，則可能發(fā)生一些片段延伸，導(dǎo)致產(chǎn)物接近預(yù)期靶標(biāo)片段的大小，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。
對于同一個(gè)基因名來說，可能會(huì)有不同的isoform。isoform指的是，對于同一個(gè)基因，它的mRNA有多種不同剪接方式，這個(gè)時(shí)候表達(dá)出來的的蛋白可能會(huì)有不同，所以小伙伴們在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，一定要想清楚自己要做的是哪一個(gè)isoform。
舉個(gè)“栗子"：比如說一個(gè)基因有四種不同的isoform，如果大家想要檢測的是四種不同剪接方式轉(zhuǎn)錄本之和，那么設(shè)計(jì)引物時(shí)就要針對這四個(gè)isoform的共有序列設(shè)計(jì)。如果只想檢測其中一種isoform，那就要在這個(gè)isoform與其他三個(gè)isoform的不同序列位置設(shè)計(jì)引物。
跨越內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物可以區(qū)分并且規(guī)避基因組DNA (gDNA)污染。gDNA可能與目的轉(zhuǎn)錄本共擴(kuò)增，產(chǎn)生無效的數(shù)據(jù)。在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中避免gDNA干擾的最佳方式是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊镌O(shè)計(jì)。
引物設(shè)計(jì)的序列最好選擇相鄰的外顯子或一端或兩端引物跨越內(nèi)含子設(shè)計(jì)。當(dāng)上游和下游引物在同一外顯子內(nèi)發(fā)生退火時(shí)，其可擴(kuò)增DNA和RNA上對應(yīng)的序列。當(dāng)引物在相鄰?fù)怙@子中退火時(shí)，只有cDNA會(huì)被擴(kuò)增，因?yàn)榇藭r(shí)源自gDNA的擴(kuò)增片段會(huì)包括內(nèi)含子序列，導(dǎo)致擴(kuò)增子太長，無法在熒光定量PCR的反應(yīng)條件下有效擴(kuò)增。
以人基因組來說，平均每個(gè)基因有8.8個(gè)外顯子和7.8個(gè)內(nèi)含子，80%的外顯子長度小于200bp，少于10%的內(nèi)含子長度在1100bp以上，不到0.01%的內(nèi)含子長度小于20bp。例如外顯子長度200bp，為了兼顧擴(kuò)增子長度，我們可以把上游引物設(shè)置在外顯子1和外顯子2的中間，下游引物設(shè)置在外顯子2的位置。
以上是引物設(shè)計(jì)需要注意的問題，在初步設(shè)計(jì)好引物之后，我們需要在NCBI上進(jìn)行BLAST檢驗(yàn)，來確保產(chǎn)物的特異性。
打開NCBI，選擇“Gene"，輸入想要檢測的基因名稱，我們以人基因“ALAD"為例。
會(huì)出現(xiàn)很多搜索結(jié)果，我們選擇需要的種屬來源，即“human"，如果你知道Gene ID（每個(gè)基因有且只有一個(gè)特定的ID，類似于人的），也可以根據(jù)Gene ID來選擇。這里我們選擇搜索結(jié)果中的第一個(gè)。
確定NM號點(diǎn)擊后，可以看到這個(gè)isoform的一些基本信息。
例如：gene代表基因長度3129bp，CDS代表編碼蛋白區(qū)域149-1141bp
以及此基因的序列，如下圖所示。此序列就是設(shè)計(jì)引物時(shí)對應(yīng)的模板。
引物設(shè)計(jì)軟件有很多，例如oligo7、Primer5、Clone Manager等，以及很多在線網(wǎng)站，例如Primerbank （）、Primer3plus 、NCBI 的Primer BLAST等。在手頭沒有安裝合適的軟件的時(shí)候，我們可以選擇在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物。
這里以延續(xù)第一步使用NCBI確定靶基因的步驟為例。了解完我們所需的isoform后，我們可以點(diǎn)擊右側(cè)的“Pick Primers"，就能直接進(jìn)入Primer-BLAST的頁面進(jìn)行引物設(shè)計(jì)了。
在彈出來的界面里粘貼模板序列或者輸入基因序列號。另外需要設(shè)置“上下游引物位置"和“擴(kuò)增子長度"。最主要的設(shè)置就是這兩點(diǎn)了，另外還有“物種名稱"、“數(shù)據(jù)庫"等其他選項(xiàng)可以設(shè)置。
設(shè)置好之后，點(diǎn)擊頁面左下角的“Get Primers"。
彈出如下界面，點(diǎn)擊“Check"
以第二步中使用的Primer-BLAST為例，輸入設(shè)計(jì)好的上下游引物，其他參數(shù)不做調(diào)整改動(dòng)，提交后即可看到輸入的引物是否在其他基因上也存在，若全部顯示在目標(biāo)擴(kuò)增的基因中，說明引物的特異性達(dá)標(biāo)。
以上是對qPCR擴(kuò)增片段和引物設(shè)計(jì)的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段和引物已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn)，小翌會(huì)陸續(xù)在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。
方法 | 分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細(xì)胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預(yù)混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預(yù)混液 (染料法)，已發(fā)文章累計(jì)IF達(dá)到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預(yù)混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預(yù)混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環(huán)法高特異性定量預(yù)混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR，1.5 h從細(xì)胞到基因表達(dá)分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉(zhuǎn)錄試劑 | 5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-常規(guī)版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
高質(zhì)鏈cDNA合成預(yù)混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預(yù)混液,含gDNA去除（下游應(yīng)用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
