第三代分子標記SNP在不同領域的應用

伴隨診斷（CDx）主要通過檢測人體內特異性蛋白或變異基因，結合藥物對在人體內的代謝特點或作用靶點，幫助醫(yī)生評估某種藥物對患者的功效和安全性，對癥下藥，根據(jù)腫瘤患者特質，使用靶向藥進行精準治療。

腫瘤伴隨診斷作為伴隨診斷領域的細分賽道之一，新產品及新技術層出不窮。腫瘤的根源可以歸結為腫瘤細胞的持續(xù)生長，相比正常細胞，其最重要的不同是產生了驅使腫瘤發(fā)生的突變基因。國內目前常見的腫瘤伴隨診斷相關的基因有12個：ALK、EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ROS1、HER2、MET、NRAS、RET、BRCA1、BRCA2，共計130＋款獲證產品。主要集中在肺癌、結直腸癌、乳腺癌等大癌種領域，以肺癌為例，EGFR基因突變是最常見的，EGFR 的熱點敏感突變包括 19 號外顯子缺失突變（19del）及 21號外顯子 L858R點突變 ，其他如 20 號外顯子 S768I 點突變亦為已知敏感突變。

從技術角度分析，CDx可采用分子診斷、免疫組學、核磁共振等技術，其中分子診斷是CDx的核心技術，目前已獲證試劑盒情況來看，主要檢測方法為熒光PCR法、熒光原位雜交、測序法等。

藥物基因組學通過研究與藥物反應相關的基因變異、RNA及蛋白質特征，尋找與藥物反應個體差異相關的基因多態(tài)性，闡明決定藥物反應個體差異的根本機制，為臨床基因導向個體化治療提供理論依據(jù)，實現(xiàn)個性化用藥。如維生素k氧化還原酶是抗凝藥物華法林的作用靶點。維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物 1的編碼基因VKORC1的遺傳變異可通過影響VKORC1表達，從而影響華法林的敏感性。位于該基因啟動子區(qū)（-1639 G>A）的單核苷酸突變 rs9923231可影響VKORC1的表達，是導致華法林用藥劑量個體差異的主要原因之一。

《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南》里面推薦的檢測方法包括PCR-直接測序法、PCR-焦磷酸測序法、熒光定量PCR法、 PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、 PCR-限制性片段長度多態(tài)性方法、原位雜交（FISH）等多種方法。從目前已獲證試劑盒情況來看，主流檢測方法為PCR熒光探針法、熒光PCR熔解曲線法等。

許多遺傳病是由點突變或者堿基片段插入缺失導致。研究數(shù)據(jù)表明，我國目前出生缺陷率為5.6%，約有22.2%的出生缺陷患兒是由單基因遺傳病導致，綜合發(fā)病率高達1/100，如臨床中常見的地中海貧血、先天性耳聾、白化病、家族性遺傳性腎炎、色盲、血友病等。

現(xiàn)有的出生缺陷防控體系可通過超聲等影像學手段篩查胎兒結構畸形、通過NIPT等技術篩查染色體異常。但是單基因遺傳病由于在胎兒發(fā)育期常常不表現(xiàn)出結構畸形，影像學檢查亦不易發(fā)現(xiàn)。因此，在孕早期或是備孕期進行常見的單基因遺傳病調控基因的檢查，進而實施有效的妊娠風險評估與產前診斷，具有重要意義。

以地中海貧血為例，地中海貧血是一種單基因隱性遺傳病，是最常見的家族遺傳性疾病之一，輕型表現(xiàn)為貧血、脾大等，重型可導致妊娠婦女胎兒死亡、出生后死亡等。根據(jù)血紅蛋白中珠蛋白肽鏈受損的不同，地貧主要分為α地貧和β地貧兩類。目前地中海貧血基因檢測已獲證試劑盒30+個，以PCR技術為主，主流檢測方法為Gap-PCR法、PCR+導流雜交法、熒光PCR溶解曲線法、PCR-熒光探針法等。

SNP由于其分布密度高、穩(wěn)定遺傳等特點，適用于人類起源、進化、遷移的研究，也非常適用于法醫(yī)個體識別和親權鑒定，通過檢測這些遺傳標記可以獲得更多的物證信息，為偵破案件提供幫助。

司法鑒定技術規(guī)范《法醫(yī)SNP分型與應用規(guī)范》指出SNP分型結果可用于補充個人識別鑒定及輔助親緣關系鑒定。由于STR片段長度相對較短，片段的退火溫度較為相似，便于實現(xiàn)多位點多重擴增，并可實現(xiàn)全自動化，當前的大型DNA數(shù)據(jù)庫都是采用STR技術建立起來的，所以STR檢測技術仍是目前法醫(yī)DNA檢測應用最為廣泛的技術，SNP分型結果主要作為STR結果的補充。

我國畜禽品種資源非常豐富，但本土種質資源的開發(fā)利用率一直偏低。因此，開展遺傳資源基因組水平上的開發(fā)和利用是現(xiàn)代畜禽遺傳改良的重要方向之一?；趩魏塑账岫鄳B(tài)性（SNP）的基因分型應用，在商業(yè)化家畜繁育中的重要性正在日益突顯，其在功能基因的檢測、分子標記輔助選擇及遺傳多樣性分析等方面發(fā)揮著重大作用。

由于過低的SNP密度會影響性狀關聯(lián)標記的挖掘效率，所以目前在畜禽育種領域，50K以上的中高密度SNP基因芯片應用較為廣泛，主要由Illumina公司的Infinium芯片技術平臺和Thermo Fisher公司的Axiom芯片技術平臺定制生產。同時國內也涌現(xiàn)出了一批院企聯(lián)合開發(fā)的芯片成果，如牧醫(yī)所與康普森等企業(yè)聯(lián)合開發(fā)的國內款自主研發(fā)的肉雞基因組育種芯片“京芯一號"，打破了國外壟斷，推動國內批自主培育白羽肉雞品種之一“廣明2號"的誕生。

隨著測序技術的迅猛發(fā)展和測序成本的超摩爾速度降低，基于二代測序的SNP分型技術在畜禽分子育種領域應用與日俱增。如簡化基因組測序分型技術已經(jīng)廣泛應用于牛、豬、羊、雞、鴨等畜禽物種研究中，其中GBS (genotyping by sequencing)分型技術已經(jīng)被廣東溫氏公司應用于杜洛克豬群體的基因組選擇育種研究，并取得了較為顯著的遺傳進展。

在動物方向的應用，涉及到的樣本量大、SNP密度高，育種專家主要是借助基因組單核苷酸標記（SNP）芯片，通過全基因組關聯(lián)研究（GWAS），進而識別與復雜性狀和常見疾病關聯(lián)的遺傳標記，促進畜禽遺傳改良。

隨著時代的發(fā)展，豐富的分子標記不斷被發(fā)現(xiàn)，先后出現(xiàn)了以RFLP，SSR，SNP為代表的三代DNA分子標記。其中簡單重復序列（SSR，也被稱為微衛(wèi)星）和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）已成為用于研究生物群體中的遺傳變異的分子標記，被廣泛應用于種質資源遺傳多樣性分析、目標性狀基因的標記與定位、抗性育種、作物品種純度鑒定及品質鑒定等方面。

像玉米、小麥、稻等主要經(jīng)濟作物都有相關國標推薦的標記物檢測方法，如GB/T 39914-2021《主要農作物品種真實性和純度SSR分子標記檢測 玉米》，目前國內植物育種技術，電泳檢測仍然為主流技術。

SNP作為新一代分子標記物，在作物領域的應用也日漸增加。由于測序成本的大幅降低，基因芯片結合基因測序應用也越來越廣泛，生物育種基因芯片利用國際前沿的功能基因組研究成果，挖掘水稻、油菜里海量的全基因組序列，在幾百萬個遺傳標記中篩選出與抗病、抗蟲、抗旱、高肥效、優(yōu)質、高產等密切相關的分子標記，經(jīng)過反復研究和驗證決選出有代表性的、能夠精準檢測的單堿基多態(tài)性（SNP）標記，助力分子育種。這些少量的SNP可以在大量樣本中進行檢測，通常采用的技術如英國LGC（政府化學家實驗室）公司的KASP技術，由于其高性價比及可搭配成套自動化設備，在作物育種領域發(fā)揮著越來越重要的作用。

目前也有一些國內廠家在開發(fā)相應的基因分型自動化設備，如瀚辰光翼的GeneMatrix系統(tǒng)是目前擁有自主知識產權的高通量基因分型系統(tǒng)，四川杰萊美自主開發(fā)的QX 基因分型系統(tǒng)適用于KASP擴增等。這些自動化設備的出現(xiàn)，也必將使得SNP分型在作物領域的應用越來越廣泛。

翌圣生物作為上游原料企業(yè)，在分子酶領域深耕多年，目前已開發(fā)了ARMS-PCR法及TaqMan探針法的SNP分型檢測通用原料，已被下游廠家應用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學、遺傳病檢測、疾病易感性研究等多個領域。