第三代分子標(biāo)記SNP在不同領(lǐng)域的應(yīng)用

伴隨診斷（CDx）主要通過檢測(cè)人體內(nèi)特異性蛋白或變異基因，結(jié)合藥物對(duì)在人體內(nèi)的代謝特點(diǎn)或作用靶點(diǎn)，幫助醫(yī)生評(píng)估某種藥物對(duì)患者的功效和安全性，對(duì)癥下藥，根據(jù)腫瘤患者特質(zhì)，使用靶向藥進(jìn)行精準(zhǔn)治療。

腫瘤伴隨診斷作為伴隨診斷領(lǐng)域的細(xì)分賽道之一，新產(chǎn)品及新技術(shù)層出不窮。腫瘤的根源可以歸結(jié)為腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)，相比正常細(xì)胞，其最重要的不同是產(chǎn)生了驅(qū)使腫瘤發(fā)生的突變基因。國(guó)內(nèi)目前常見的腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因有12個(gè)：ALK、EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ROS1、HER2、MET、NRAS、RET、BRCA1、BRCA2，共計(jì)130＋款獲證產(chǎn)品。主要集中在肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等大癌種領(lǐng)域，以肺癌為例，EGFR基因突變是最常見的，EGFR 的熱點(diǎn)敏感突變包括 19 號(hào)外顯子缺失突變（19del）及 21號(hào)外顯子 L858R點(diǎn)突變 ，其他如 20 號(hào)外顯子 S768I 點(diǎn)突變亦為已知敏感突變。

從技術(shù)角度分析，CDx可采用分子診斷、免疫組學(xué)、核磁共振等技術(shù)，其中分子診斷是CDx的核心技術(shù)，目前已獲證試劑盒情況來看，主要檢測(cè)方法為熒光PCR法、熒光原位雜交、測(cè)序法等。

藥物基因組學(xué)通過研究與藥物反應(yīng)相關(guān)的基因變異、RNA及蛋白質(zhì)特征，尋找與藥物反應(yīng)個(gè)體差異相關(guān)的基因多態(tài)性，闡明決定藥物反應(yīng)個(gè)體差異的根本機(jī)制，為臨床基因?qū)騻€(gè)體化治療提供理論依據(jù)，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化用藥。如維生素k氧化還原酶是抗凝藥物華法林的作用靶點(diǎn)。維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物 1的編碼基因VKORC1的遺傳變異可通過影響VKORC1表達(dá)，從而影響華法林的敏感性。位于該基因啟動(dòng)子區(qū)（-1639 G>A）的單核苷酸突變 rs9923231可影響VKORC1的表達(dá)，是導(dǎo)致華法林用藥劑量個(gè)體差異的主要原因之一。

《藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指南》里面推薦的檢測(cè)方法包括PCR-直接測(cè)序法、PCR-焦磷酸測(cè)序法、熒光定量PCR法、 PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法、原位雜交（FISH）等多種方法。從目前已獲證試劑盒情況來看，主流檢測(cè)方法為PCR熒光探針法、熒光PCR熔解曲線法等。

許多遺傳病是由點(diǎn)突變或者堿基片段插入缺失導(dǎo)致。研究數(shù)據(jù)表明，我國(guó)目前出生缺陷率為5.6%，約有22.2%的出生缺陷患兒是由單基因遺傳病導(dǎo)致，綜合發(fā)病率高達(dá)1/100，如臨床中常見的地中海貧血、先天性耳聾、白化病、家族性遺傳性腎炎、色盲、血友病等。

現(xiàn)有的出生缺陷防控體系可通過超聲等影像學(xué)手段篩查胎兒結(jié)構(gòu)畸形、通過NIPT等技術(shù)篩查染色體異常。但是單基因遺傳病由于在胎兒發(fā)育期常常不表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)畸形，影像學(xué)檢查亦不易發(fā)現(xiàn)。因此，在孕早期或是備孕期進(jìn)行常見的單基因遺傳病調(diào)控基因的檢查，進(jìn)而實(shí)施有效的妊娠風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與產(chǎn)前診斷，具有重要意義。

以地中海貧血為例，地中海貧血是一種單基因隱性遺傳病，是最常見的家族遺傳性疾病之一，輕型表現(xiàn)為貧血、脾大等，重型可導(dǎo)致妊娠婦女胎兒死亡、出生后死亡等。根據(jù)血紅蛋白中珠蛋白肽鏈?zhǔn)軗p的不同，地貧主要分為α地貧和β地貧兩類。目前地中海貧血基因檢測(cè)已獲證試劑盒30+個(gè)，以PCR技術(shù)為主，主流檢測(cè)方法為Gap-PCR法、PCR+導(dǎo)流雜交法、熒光PCR溶解曲線法、PCR-熒光探針法等。

SNP由于其分布密度高、穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，適用于人類起源、進(jìn)化、遷移的研究，也非常適用于法醫(yī)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定，通過檢測(cè)這些遺傳標(biāo)記可以獲得更多的物證信息，為偵破案件提供幫助。

司法鑒定技術(shù)規(guī)范《法醫(yī)SNP分型與應(yīng)用規(guī)范》指出SNP分型結(jié)果可用于補(bǔ)充個(gè)人識(shí)別鑒定及輔助親緣關(guān)系鑒定。由于STR片段長(zhǎng)度相對(duì)較短，片段的退火溫度較為相似，便于實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)多重?cái)U(kuò)增，并可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，當(dāng)前的大型DNA數(shù)據(jù)庫(kù)都是采用STR技術(shù)建立起來的，所以STR檢測(cè)技術(shù)仍是目前法醫(yī)DNA檢測(cè)應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，SNP分型結(jié)果主要作為STR結(jié)果的補(bǔ)充。

我國(guó)畜禽品種資源非常豐富，但本土種質(zhì)資源的開發(fā)利用率一直偏低。因此，開展遺傳資源基因組水平上的開發(fā)和利用是現(xiàn)代畜禽遺傳改良的重要方向之一?；趩魏塑账岫鄳B(tài)性（SNP）的基因分型應(yīng)用，在商業(yè)化家畜繁育中的重要性正在日益突顯，其在功能基因的檢測(cè)、分子標(biāo)記輔助選擇及遺傳多樣性分析等方面發(fā)揮著重大作用。

由于過低的SNP密度會(huì)影響性狀關(guān)聯(lián)標(biāo)記的挖掘效率，所以目前在畜禽育種領(lǐng)域，50K以上的中高密度SNP基因芯片應(yīng)用較為廣泛，主要由Illumina公司的Infinium芯片技術(shù)平臺(tái)和Thermo Fisher公司的Axiom芯片技術(shù)平臺(tái)定制生產(chǎn)。同時(shí)國(guó)內(nèi)也涌現(xiàn)出了一批院企聯(lián)合開發(fā)的芯片成果，如牧醫(yī)所與康普森等企業(yè)聯(lián)合開發(fā)的國(guó)內(nèi)款自主研發(fā)的肉雞基因組育種芯片“京芯一號(hào)"，打破了國(guó)外壟斷，推動(dòng)國(guó)內(nèi)批自主培育白羽肉雞品種之一“廣明2號(hào)"的誕生。

隨著測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展和測(cè)序成本的超摩爾速度降低，基于二代測(cè)序的SNP分型技術(shù)在畜禽分子育種領(lǐng)域應(yīng)用與日俱增。如簡(jiǎn)化基因組測(cè)序分型技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于牛、豬、羊、雞、鴨等畜禽物種研究中，其中GBS (genotyping by sequencing)分型技術(shù)已經(jīng)被廣東溫氏公司應(yīng)用于杜洛克豬群體的基因組選擇育種研究，并取得了較為顯著的遺傳進(jìn)展。

在動(dòng)物方向的應(yīng)用，涉及到的樣本量大、SNP密度高，育種專家主要是借助基因組單核苷酸標(biāo)記（SNP）芯片，通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），進(jìn)而識(shí)別與復(fù)雜性狀和常見疾病關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記，促進(jìn)畜禽遺傳改良。

隨著時(shí)代的發(fā)展，豐富的分子標(biāo)記不斷被發(fā)現(xiàn)，先后出現(xiàn)了以RFLP，SSR，SNP為代表的三代DNA分子標(biāo)記。其中簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR，也被稱為微衛(wèi)星）和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）已成為用于研究生物群體中的遺傳變異的分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、目標(biāo)性狀基因的標(biāo)記與定位、抗性育種、作物品種純度鑒定及品質(zhì)鑒定等方面。

像玉米、小麥、稻等主要經(jīng)濟(jì)作物都有相關(guān)國(guó)標(biāo)推薦的標(biāo)記物檢測(cè)方法，如GB/T 39914-2021《主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè) 玉米》，目前國(guó)內(nèi)植物育種技術(shù)，電泳檢測(cè)仍然為主流技術(shù)。

SNP作為新一代分子標(biāo)記物，在作物領(lǐng)域的應(yīng)用也日漸增加。由于測(cè)序成本的大幅降低，基因芯片結(jié)合基因測(cè)序應(yīng)用也越來越廣泛，生物育種基因芯片利用國(guó)際前沿的功能基因組研究成果，挖掘水稻、油菜里海量的全基因組序列，在幾百萬個(gè)遺傳標(biāo)記中篩選出與抗病、抗蟲、抗旱、高肥效、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等密切相關(guān)的分子標(biāo)記，經(jīng)過反復(fù)研究和驗(yàn)證決選出有代表性的、能夠精準(zhǔn)檢測(cè)的單堿基多態(tài)性（SNP）標(biāo)記，助力分子育種。這些少量的SNP可以在大量樣本中進(jìn)行檢測(cè)，通常采用的技術(shù)如英國(guó)LGC（政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室）公司的KASP技術(shù)，由于其高性價(jià)比及可搭配成套自動(dòng)化設(shè)備，在作物育種領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。

目前也有一些國(guó)內(nèi)廠家在開發(fā)相應(yīng)的基因分型自動(dòng)化設(shè)備，如瀚辰光翼的GeneMatrix系統(tǒng)是目前擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高通量基因分型系統(tǒng)，四川杰萊美自主開發(fā)的QX 基因分型系統(tǒng)適用于KASP擴(kuò)增等。這些自動(dòng)化設(shè)備的出現(xiàn)，也必將使得SNP分型在作物領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。

翌圣生物作為上游原料企業(yè)，在分子酶領(lǐng)域深耕多年，目前已開發(fā)了ARMS-PCR法及TaqMan探針法的SNP分型檢測(cè)通用原料，已被下游廠家應(yīng)用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學(xué)、遺傳病檢測(cè)、疾病易感性研究等多個(gè)領(lǐng)域。