1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性"的演講上采用“克?。–lone）"的術(shù)語，把“克隆技術(shù)"帶到了人們的視野中，其本身的含義是無性繁殖。

克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)"，它經(jīng)歷了三個(gè)發(fā)展時(shí)期：

目前應(yīng)用技術(shù)為“分子克隆"，又稱重組DNA技術(shù)，是將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀。

傳統(tǒng)分子克隆實(shí)驗(yàn)流程如下圖：

圖1.傳統(tǒng)分子克隆實(shí)驗(yàn)流程

傳統(tǒng)分子克隆載體制備的第一步是通過限制性酶切構(gòu)建插入位點(diǎn)。限制性內(nèi)切酶的選擇取決于載體和插入片段上是否存在相應(yīng)的識別序列、識別序列的位置以及是否適于連接。MCS往往是插入片段的，因?yàn)樵搮^(qū)域?qū)Ｓ糜诳寺　?/span>

翌圣的FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶能快速、精準(zhǔn)完成DNA切割。載體酶切后，為防止自連，可能有必要進(jìn)行載體的去磷酸化，尤其當(dāng)載體酶切后末端可互補(bǔ)或是平端時(shí)。載體的去磷酸化對于降低背景、促進(jìn)所需片段插入載體非常重要。

圖2.FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶

（Cat#15001ES-15051ES）

克隆的插入片段來源可能為基因組DNA、另一質(zhì)粒的一部分或者線性DNA片段。制備插入片段時(shí)常用的步驟是選擇適于將插入片段克隆進(jìn)載體的限制性內(nèi)切酶，進(jìn)行限制性酶切，產(chǎn)生匹配的粘性末端，以便接下來將片段插入在載體中。對插入片段和載體進(jìn)行雙酶切，以實(shí)現(xiàn)定向克隆。

插入片段和載體經(jīng)酶切后，可在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并切割出目標(biāo)片段，純化所需的片段。使用翌圣的瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Cat#19101ES）能保證實(shí)驗(yàn)流程高效、結(jié)果可靠、得率高。

制備插入片段另一個(gè)方法是通過高保真PCR（翌圣高保真PCR Cat#10164ES）試劑擴(kuò)增所需要的插入片段，可加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)或同源重組片段，純化后進(jìn)行連接。

獲得目標(biāo)片段后，可以構(gòu)建連接反應(yīng)，連接插入片段和載體。常用的連接酶為T4 DNA連接酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶。T4 DNA連接酶可連接DNA末端的5’-磷酸基和3’-羥基。

拓?fù)洚悩?gòu)酶是指通過切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來更正DNA連環(huán)數(shù)的酶，需根據(jù)DNA片段的末端為粘性末端或者平末端來選擇不同的TOPO克隆試劑盒，如翌圣TOPO克隆系列—TA/Blunt（Cat#10907-10910）。

圖3.Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit（Cat#10907）可有效克隆1-5 kb基因，100%。

注：A-C：TOPO克隆轉(zhuǎn)化平板；D-F：插入片段PCR鑒定電泳圖。

不經(jīng)過酶切的片段可使用同源重組酶連接到線性載體上。首先將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，經(jīng)過一定的時(shí)間和溫度即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。

同源重組酶可連接單片段或者多片段，根據(jù)插入片段數(shù)的不同，選擇不同的一步法快速克隆試劑盒，如翌圣的Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒（Cat#10911ES）、Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒（Cat#10922ES）。

圖4.同源重組原理

圖5.Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit（Cat#10911ES）試劑盒可以有效克隆不同長度的單片段基因

注：載體：4.7 kb；插入片段：1.2 kb，3 kb和5 kb。

轉(zhuǎn)化是細(xì)菌細(xì)胞低頻率吸收外界DNA的自然過程。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，用來在專門為吸收DNA而制備的“感受態(tài)"細(xì)菌內(nèi)增殖質(zhì)粒?？筛鶕?jù)下游應(yīng)用的不同，選擇不同的感受態(tài)細(xì)胞，常見的有DH5α化學(xué)感受態(tài)、10化學(xué)感受態(tài)、BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)等。

市面上提供可實(shí)現(xiàn)高效、可靠轉(zhuǎn)染的感受態(tài)細(xì)胞。制備可進(jìn)行轉(zhuǎn)化的“感受態(tài)"細(xì)菌的常用方法是采用氯化鈣處理對數(shù)期細(xì)菌細(xì)胞。將化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和連接反應(yīng)物混合，然后在42°C下熱激活，部分DNA會被細(xì)菌細(xì)胞吸收，并在細(xì)胞內(nèi)開始復(fù)制。為了加快感受態(tài)轉(zhuǎn)化的流程，市面上也有應(yīng)運(yùn)而生的快速感受態(tài)，如翌圣F DH5α化學(xué)感受態(tài)（Cat#11803ES），10分鐘就能完成快速轉(zhuǎn)化。

圖6.感受態(tài)轉(zhuǎn)化流程

隨后，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌置于含有適量抗生素的瓊脂板上，通過藍(lán)白斑篩選或其它方法篩選含有所需質(zhì)粒及插入片段的菌落。

轉(zhuǎn)化反應(yīng)的菌液中，同時(shí)包含不帶載體的細(xì)胞、不含插入片段的載體、純插入片段、以及成功連接的載體和插入片段。為了獲得連接成功的載體和插入片段，可通過含有抗生素的平板進(jìn)行篩選，不含載體的細(xì)菌缺少抗生素耐受性基因，因而不會生長。

但經(jīng)轉(zhuǎn)化后含有載體的細(xì)菌，不論帶或不帶插入片段都能表達(dá)抗生素耐受性基因，因而可存活。為確定轉(zhuǎn)化的菌落是否含有插入片段，可采用多種方法，其中常用的是藍(lán)白斑篩選法和陽性克隆篩選法。

藍(lán)白斑篩選法，將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布到含有l(wèi)acZ轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)子、IPTG（Cat#10902ES）、X-gal（LacZ顯色底物，Cat#10901ES）的生長培養(yǎng)基上，LacZ會水解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色染料進(jìn)而形成藍(lán)色菌落。當(dāng)插入片段破壞了載體編碼的lacZα基因時(shí)，無法形成功能性LacZ，經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落呈白色。

圖7.藍(lán)白斑篩選原理

陽性克隆篩選法，即在載體的MCS之中含有一個(gè)對于細(xì)菌宿主致命的基因。當(dāng)插入片段成功連接到MCS內(nèi)的致命基因內(nèi)，可阻止其表達(dá)，從而確保只帶有插入片段載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能存活。

圖8.陽性克隆篩選原理

為了進(jìn)一步驗(yàn)證，還需要對從陽性菌落或白色菌落中提取的載體進(jìn)行酶切，進(jìn)行凝膠電泳，確定其條帶圖譜是否與所插入目的片段的條帶大小一致。還可通過菌落PCR法判斷DNA片段是否插入（翌圣快速PCR Cat#10157ES）；或通過測序確定插入片段基因是否突變等。

通過上述對“分子克隆技術(shù)"的介紹，相信大家已經(jīng)充分認(rèn)識到“分子克隆技術(shù)"在生物學(xué)研究領(lǐng)域是如基石一樣的存在，它的出現(xiàn)和應(yīng)用開辟了分子遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，作為生物技術(shù)界的頂流，它打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創(chuàng)造新物種的大門。它的成就對于工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，并將為解決世界面臨的能源、食品和環(huán)保三大危機(jī)開拓一條新的出路。相信大家能通過這門技術(shù)，為世界探索真理、創(chuàng)造美好未來。