熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團來記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達到對PCR過程進行實時監(jiān)控的目的，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源。

熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節(jié)，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生呢？

對于熒光定量PCR反應體系而言，cDNA模板的質(zhì)量至關(guān)重要。cDNA模板的濃度、純度、是否有一定程度的降解等等，都會影響熒光定量PCR的實驗結(jié)果。絕大多數(shù)情況下，cDNA的質(zhì)量和對應的RNA質(zhì)量密切相關(guān)，高質(zhì)量的RNA保證了高質(zhì)量的cDNA。

基于有機試劑的一步萃取是一種非常有效的方法，能夠從多種細胞和組織中分離純化RNA。通常使用苯酚和異硫氰酸胍混合物(類似trizol)來破壞細胞并溶解細胞成分，同時異硫氰酸胍是一種離液鹽，可保護核酸免受RNase的侵害以保證核酸的完整性。后加入氯仿并通過離心可將混合物分離成水相和有機相。在異硫氰酸胍存在下，RNA僅保留在水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則轉(zhuǎn)移到有機相和中間相中，最后通過異丙醇沉淀從水相中回收RNA。

該過程相對來說較快，可以產(chǎn)生較多的RNA，但是其中需要使用有毒的化學物質(zhì)，與其他RNA提取方法相比，可能導致更高的DNA殘留。殘留剩下的胍、苯酚或醇也會顯著降低cDNA的合成效率。

使用硅膠膜或磁珠的方法時，生物樣本會在異硫氰酸胍存在下進行裂解和均質(zhì)(均質(zhì)：由不同的成分互不相溶而產(chǎn)生均勻的混合物)。均質(zhì)化后，將乙醇加入樣品中，RNA會與硅膠膜或磁珠結(jié)合，并通過洗滌的方式去除雜質(zhì)。該方法相較于有機萃取更省時，并且不需要苯酚。RNA產(chǎn)量可能沒有有機萃取方式來的高，但是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、DNA等殘留明顯減少。當然，由于不洗滌，仍有可能發(fā)生胍和乙醇的殘留，對cDNA合成效率產(chǎn)生一定的影響。

通常有機裂解和硅膠吸附相結(jié)合，可以做到樣本充分裂解，RNA提取更加簡便、快速和高純度。

常見評估RNA質(zhì)量的方法有四種，分別是紫外光譜法(分光光度計測量)、核酸電泳、Qubit熒光測量和毛細管電泳分析法。

紫外光譜法是一種傳統(tǒng)且簡單的測量方法，大多數(shù)實驗室均配備分光光度計。通常會檢測三個值，分別是A230、A260和A280。

A230是鹽類、多糖、有機溶劑等最高吸收峰的吸收波長，包括胍、EDTA、TritonTMX-100、Trizol、乙醇、多糖等最高吸收峰均接近230 nm。

A260是核酸最高吸收峰的吸收波長，由于核酸結(jié)構(gòu)中的芳香堿基部分，包括嘧啶堿基（T、C、U）與嘌呤堿基（A、G）的最高吸收峰均在260 nm，因此A260值可用于核酸定量計算。

A280是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長，蛋白質(zhì)中色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸與胍氨酸的芳香氨基酸鏈與有機化合物中的芳香性苯酚的最高吸收峰均接近280 nm。

其中A260/A280＞2.2表示RNA降解常為經(jīng)驗判斷，并沒有文章驗證依據(jù)。判斷RNA是否發(fā)生降解辦法是跑電泳進行鑒定。

紫外光譜法雖然高效方便，但其也存在一定的不足。紫外吸光度可能會受到以下幾點的影響：

• 游離核苷酸的存在。吸光度不能區(qū)分核酸和游離核苷酸。并且游離核苷酸在 260 nm 處比核酸吸收更多，數(shù)值會受干擾，而非真實數(shù)據(jù)。

• 紫外吸光度測量無法區(qū)分同一樣品中的RNA和DNA。

• 純化核酸樣品中通常存在的污染物(例如蛋白質(zhì))有助于紫外吸光度讀數(shù)。

另一種常見的RNA質(zhì)量評估方法是瓊脂糖凝膠電泳。該方法可以判斷RNA樣本的降解情況、基因組殘留和蛋白殘留情況。

▲高質(zhì)量的RNA電泳會有三條比較明顯的條帶，分別是28S，18S與5S核糖體RNA條帶，并且28S與18S的條帶亮度之比大體為2：1。當RNA出現(xiàn)降解時，條帶會呈現(xiàn)彌散狀

▲當基因組DNA有殘留時，泳道上部會有明顯的高分子DNA條帶

▲當存在蛋白殘留時，點樣孔中會有比較亮的著色成分

當RNA樣本中存在基因組DNA(gDNA)殘留時，可能會在下游PCR實驗或者下游熒光定量PCR實驗中出現(xiàn)非特異擴增。在熒光定量PCR中直接的表現(xiàn)是Ct值明顯偏小，且熔解曲線出現(xiàn)雙峰。

目前有三種方法可以避免RNA樣本中g(shù)DNA的干擾。其中的方法是做好引物設(shè)計，跨內(nèi)含子且不在單個外顯子模塊中設(shè)計上下游引物。

當引物設(shè)計不可避免或已完成了引物合成，則可以在RNA提取時選取帶有g(shù)DNA去除功能的RNA提取試劑盒或在反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA時選用帶有g(shù)DNA去除功能的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

在正式進行cDNA合成之前，我們需要明確cDNA合成的模板是什么，是作用于RNA沉默和基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的MicroRNA？還是涉及多個細胞過程的小型非編碼RNA？還是將DNA信息轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)產(chǎn)物氨基酸序列的mRNA？還是其他類型的RNA？不同的RNA合成cDNA所需要的引物會有所不同，應按需調(diào)整。

以RNA為模板合成第一鏈cDNA的過程為反轉(zhuǎn)錄。該步驟是反轉(zhuǎn)定量中變化最大的一步，該步驟中可以使用隨機引物、Oligo dT或序列特異性引物，引物選擇在反轉(zhuǎn)錄效率、一致性和準確性上有著重要的作用。

Oligo dT引物是常見反轉(zhuǎn)錄反應的，因為其對mRNA具有特異性，并且可以從同一cDNA庫中分析許多不同的靶標。然而，由于其總在轉(zhuǎn)錄本RNA的3'末端啟動反轉(zhuǎn)錄，二級結(jié)構(gòu)的存在可能導致cDNA合成不完整。

隨機引物能夠產(chǎn)生大量的cDNA，其在熒光定量 PCR 中具有最高的靈敏度。同時隨機引物也是無poly A尾RNA的理想選擇，例如原核生物RNA。隨機引物在整個RNA轉(zhuǎn)錄本中退火，產(chǎn)生多個擴增位點，從而能夠產(chǎn)生含有不同長度的cDNA。降解的RNA和復雜的二級結(jié)構(gòu)對隨機引物不會造成太大的影響。隨機引物可以提高產(chǎn)量，但單獨使用也會產(chǎn)生拷貝數(shù)被高估的風險。隨機引物和Oligo dT引物的組合通?？梢酝ㄟ^在同一反轉(zhuǎn)錄反應中結(jié)合兩者的優(yōu)點來以提高cDNA的質(zhì)量。

基因特異性引物具有最大的特異性，并且是反轉(zhuǎn)錄引物選擇中最為一致的。然而，這類引物沒有Oligo dT和隨機引物的靈活性，只產(chǎn)生靶基因產(chǎn)物所對應的cDNA。

在正式測量cDNA濃度之前，可能需要了解一下，cDNA濃度是否需要測量？通常反轉(zhuǎn)錄后所獲得的cDNA產(chǎn)物是一個混合體系，其中包含cDNA、未反轉(zhuǎn)錄的RNA、游離的核苷酸(dNTP)、殘余的引物以及各類蛋白和鹽離子等成分，會干擾cDNA的吸光值，從而影響判斷。

尤其是dNTP，該成分對于紫外光譜的影響較大。經(jīng)實驗驗證，反轉(zhuǎn)錄體系中dNTP 投入量的多少會使cDNA濃度的測定結(jié)果產(chǎn)生較大差異，但最終Ct值幾乎一致，qPCR檢測結(jié)果△Ct＜1。

▲Nanodrop定量結(jié)果統(tǒng)計表

▲qPCR檢測結(jié)果△Ct＜1，且Ct值與 Nanodrop 定量結(jié)果無線性關(guān)系

cDNA濃度的測定受多因素影響，故可以選擇不進行cDNA濃度的測定。另外同一批RNA濃度調(diào)整后，默認同一批次做的反轉(zhuǎn)錄效率是一致的，cDNA和RNA投入量呈現(xiàn)線性正相關(guān)，cDNA的濃度高低后續(xù)可通過熒光定量PCR反應中的內(nèi)參數(shù)據(jù)來反映。故而在進行cDNA合成時，保證好高質(zhì)量無降解的RNA，即可獲取高質(zhì)量的cDNA及準確的實驗數(shù)據(jù)。

以上是對如何獲取高質(zhì)量cDNA的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何獲取高質(zhì)量cDNA已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實驗，小翌會陸續(xù)在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。