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E.coli殘留RNA檢測Kit，嚴(yán)格監(jiān)測質(zhì)粒DNA純度

2023-8-16　　閱讀(265)

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E.coli宿主菌應(yīng)用及其殘留RNA質(zhì)控


 

已知，大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)是分子量較小蛋白或結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單蛋白表達(dá)的宿主，主要表達(dá)胰島素、干擾素和白介素等細(xì)胞因子類藥物，這些藥物中宿主殘留核酸和蛋白的含量需要嚴(yán)格控制。另外，在細(xì)胞和基因治療等領(lǐng)域，E.coli宿主菌通常被用于起始原材料質(zhì)粒DNA的制備。質(zhì)粒DNA做為細(xì)胞治療和基因治療藥物的中間品或終產(chǎn)品，其中RNA片段的殘留可能會(huì)降低DNA產(chǎn)品純度，還可能會(huì)對(duì)其品質(zhì)和安全性等產(chǎn)生一定的干擾，因此需對(duì)質(zhì)粒DNA樣本中宿主菌殘留RNA的含量加以限制。

 

采用經(jīng)驗(yàn)證的發(fā)酵和純化工藝雖然可以去除一部分宿主細(xì)胞RNA（HCR）等殘留雜質(zhì)成分，但產(chǎn)品中仍然可能會(huì)有HCR殘留。為保障生產(chǎn)的臨床級(jí)質(zhì)粒DNA的純度和生物學(xué)活性，HCR檢測項(xiàng)目成為了生物制品生產(chǎn)工藝中重要的質(zhì)量檢測指標(biāo)之一。

 

殘留RNA法規(guī)監(jiān)管要求

 

據(jù)了解，各監(jiān)管機(jī)構(gòu)在判定DNA產(chǎn)品純度時(shí)，均會(huì)將宿主細(xì)胞RNA含量作為其中一項(xiàng)關(guān)鍵檢測指標(biāo)。
 
美國FDA中明確規(guī)定了質(zhì)粒材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：超螺旋DNA＞85%，宿主細(xì)胞蛋白＜1%，殘留細(xì)菌DNA＜1%（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定），殘留細(xì)菌RNA＜1%（高效液相色譜法或凝膠法檢測不到）。歐洲藥品管理局（EMA）在《基因治療藥物產(chǎn)品的質(zhì)量、非臨床和臨床方面的指導(dǎo)原則》中，提出應(yīng)考慮宿主細(xì)胞殘留RNA，以確定質(zhì)粒純度?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版第三部人用基因治療制品總論中規(guī)定，應(yīng)建立基因治療制品物理數(shù)量和生物數(shù)量的含量檢測指標(biāo)，可以通過諸如總顆粒數(shù)、感染性滴度或感染性顆粒數(shù)、基因組DNA/RNA或質(zhì)粒DNA濃度等的檢測來確定含量。
 
此外，2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）中也明確指出需對(duì)生產(chǎn)工藝引入的工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞RNA等納入產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。

 

殘留RNA檢測方法

 

已知，對(duì)于生物制品的起始原材料質(zhì)粒DNA中的宿主菌RNA殘留檢測，通常采用20年版中國藥典0541通則瓊脂糖凝膠電泳法。此外，USP在今年4月發(fā)布了《mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案》(第二版)，對(duì)于質(zhì)粒DNA質(zhì)量屬性的測試中提到了：宿主細(xì)胞RNA檢測可采用高效液相色譜或瓊脂糖凝膠電泳法。
 
除了瓊脂糖凝膠電泳和高效液相色譜法外，行業(yè)內(nèi)還會(huì)采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）和RNA熒光定量方法檢測生物制品中的宿主細(xì)胞殘留RNA。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法由于是通過設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測樣本中的宿主細(xì)胞殘留RNA高度專一性擴(kuò)增和精確定量，因此該方法得到了業(yè)內(nèi)的廣泛應(yīng)用。
 
針對(duì)上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了E.coli宿主細(xì)胞殘留RNA檢測試劑盒，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）原理，設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系將待測樣本中的殘留RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)檢測殘留的總RNA含量。樣本類型包括：使用E.coli宿主菌進(jìn)行分子酶、重組蛋白等表達(dá)產(chǎn)物制備的樣本，以及使用E.coli宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA類樣本。不僅如此，我們還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒、DNase試劑以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器。

 

E.coli殘留RNA檢測Kit產(chǎn)品性能

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

  • 符合法規(guī)：按照Chp、USP、ICHQ2（R2）等要求進(jìn)行全面驗(yàn)證，性能符合中外法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)；

  • 保障品質(zhì)：試劑盒原材料全自主研發(fā)，qPCR Mix等酶產(chǎn)品在超潔凈酶工廠生產(chǎn)；

  • 配合審計(jì)：保障試劑盒生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，批間差可控，有完善的審計(jì)文件；

  • 靈敏度高：定量下限(LLOQ)可達(dá)1fg/μL水平；

  • 專屬性強(qiáng)：特異性檢測E.coli細(xì)胞殘留RNA，不受其他外源基因組DNA和RNA干擾。

 

 

產(chǎn)品信息

 

產(chǎn)品貨號(hào)品名規(guī)格
樣本前處理
試劑盒		18461ESMolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit
磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝）		25T/100T
18462ESMolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA
磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預(yù)封裝）		2×16T/
6×16T
核酸提取儀器80501ESAuto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system
 Auto-Pure 32A全自動(dòng)核酸提取儀		32通量
DNA酶14534ESRecombinant DNase I (RNase-free, Yeast)50U/100U
殘留RNA檢測
試劑盒		41318ESE.coli Host Cell RNA Residue Detection Kit
E.coli 宿主細(xì)胞 RNA 殘留檢測試劑盒		50T/100T

 

參考文獻(xiàn)：

[1]European Medicines Agency, 2019. Guideline on quality, non-clinical and clinical requirements for investigational advanced therapy medicinal products in clinical trials.

[2]中國藥典委員會(huì)（ChPC）.《中國藥典》三部[S].北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，2020：542-543.

[3]《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，2022年5月。

[4]USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality (Draft Guidelines).

 

翌圣質(zhì)控產(chǎn)品推薦

 

產(chǎn)品定位產(chǎn)品名稱貨號(hào)規(guī)格
樣本核酸提取MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit
磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝）		18461ES25/6025 T/100 T
MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA
磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預(yù)封裝）		18462ES32/592×16 T/6×16 T
MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA (Prepackaged, Pointed Bottom Plate)
磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預(yù)封裝，尖底板）		18463ES32/592×16 T/6×16 T
Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system
 Auto-Pure 32A全自動(dòng)核酸提取儀		80501ES32通量
宿主殘留DNA檢測CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit（2G）
CHO宿主細(xì)胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）		41305ES50/6050 T/100 T
HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit （2G）
HEK293宿主細(xì)胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）		41306ES50/6050 T/100 T
Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit（2G）
Vero宿主細(xì)胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）		41307ES50/6050 T/100 T
E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit（2G）
E.coli宿主細(xì)胞DNA殘留檢測試劑盒（2G）		41308ES50/6050 T/100 T
Hansenula polymorpha Host Cell DNA Residue Detection Kit
漢遜酵母宿主細(xì)胞DNA殘留檢測試劑盒		41317ES50 T/100 T
殘留DNA片段分析Vero Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit
Vero宿主細(xì)胞殘留DNA片段分析試劑盒		41314ES70/744×50 T/4×100 T
HEK293 Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit
HEK293宿主細(xì)胞殘留DNA片段分析試劑盒		41316ES70/744×50 T/4×100 T
宿主殘留RNA檢測E.coli Host Cell RNA Residue Detection Kit
E.coli宿主細(xì)胞RNA殘留檢測試劑盒		41318ES50/6050 T/100 T
風(fēng)險(xiǎn)基因檢測SV40LTA&E1A Residue DNA Detection Kit
SV40LTA&E1A殘留DNA檢測試劑盒		41310ES50/6050 T/100 T
Replication-competent Lentivirus (RCL) Detection Kit
復(fù)制型慢病毒(RCL)檢測試劑盒		41311ES50/6050 T/100 T
CAR/TCR Copynumber Detection Kit
CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測試劑盒		41313ES50/6050 T/100 T
支原體檢測MycAway™ Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit 
支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）		40618ES25/6025 T/100 T
宿主殘留蛋白檢測E.coli HCP ELISA kit
E.coli HCP ELISA檢測試劑盒		36712ES48/9648 T/96 T
HEK293 HCP ELISA kit
HEK293 HCP ELISA檢測試劑盒		36713ES48/9648 T/96 T
CHO HCP ELISA kit (CHO-K1)
CHO HCP ELISA檢測試劑盒(CHO-K1)		36714ES48/9648 T/96 T
核酸酶殘留檢測UCF.ME® UltraNuclease（M）ELISA Kit
全能核酸酶（M級(jí)）檢測試劑盒		36702ES48/9648 T/96 T
Salt Active UltraNuclease ELISA kit
耐高鹽全能核酸酶ELISA試劑盒		36703ES48/9648 T/96 T
其他蛋白殘留檢測Protein A ELISA Kit
Protein A ELISA檢測試劑盒		36716ES48/9648 T/96 T
T7 RNA Polymerase ELISA kit
T7 RNA聚合酶ELISA檢測試劑盒		36705ES48/9648 T/96 T
Inorganic Pyrophosphatase ELISA kit
無機(jī)焦磷酸酶ELISA檢測試劑盒		36706ES48/9648 T/96 T
Murine RNase Inhibitor ELISA Kit
鼠源RNase抑制劑ELISA檢測試劑盒		36707ES48/9648 T/96 T
Vaccinia Capping Enzyme ELISA kit
牛痘病毒加帽酶ELISA檢測試劑盒		36709ES48/9648 T/96 T
RNase/DNase殘留檢測RNase Viability Assay Kit (Fluorescent Labeling)
RNase活性檢測試劑盒（熒光標(biāo)記法）		41309ES96/971×96 T/5×96 T
DNase Viability Assay Kit (Fluorescent Labeling)
DNase 活性檢測試劑盒（熒光標(biāo)記法）		41322ES48/6848 T/192 T



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