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CUT&Tag優(yōu)于ChIP-Seq的關(guān)鍵竟是它？
前面幾期，小翌介紹過“翌圣轉(zhuǎn)座酶系列產(chǎn)品助力NGS文庫(kù)構(gòu)建"（戳鏈接了解詳情）。本期，小翌重點(diǎn)聊聊pG-Tn5。
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一種新的DNA-蛋白質(zhì)互作研究方法，該技術(shù)涉及的核心酶原料是pG-Tn5或pA-Tn5(pA-Tn5 Transposase)。Protein A(pA)與pG的作用類似，特異性結(jié)合抗體，從而使得pA-Tn5具備更高的靶向性。Protein A 和 Protein G與不同種類和免疫原性的抗體的親和力具有較大區(qū)別[1]，因此pA和pG可以靶向結(jié)合不同抗體。
與傳統(tǒng)的ChIP-Seq相比，CUT&Tag不需要使用甲醛交聯(lián)以及免疫共沉淀，而是通過針對(duì)靶蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑蛋白）的抗體和Protein G/A的介導(dǎo)，使得與Protein G/A融合的Tn5酶在切割DNA片段的同時(shí)在序列兩端加上測(cè)序接頭，經(jīng)PCR擴(kuò)增后即可形成用于高通量測(cè)序的文庫(kù)（圖1）。CUT &Tag技術(shù)具有細(xì)胞投入量低、信噪比高、實(shí)驗(yàn)周期短（1天實(shí)現(xiàn)文庫(kù)構(gòu)建）、可重復(fù)性好等顯著優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于蛋白質(zhì)與DNA互作研究、檢測(cè)組蛋白修飾在基因組上分布位點(diǎn)、鑒定轉(zhuǎn)錄因子在全基因組上的結(jié)合位點(diǎn)、超級(jí)增強(qiáng)子鑒定等。
圖1. CUT &Tag技術(shù)原理圖[2]
由于CUT&Tag主要是針對(duì)極低細(xì)胞起始量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這就要求核心酶原料具有高切割活性、對(duì)微量DNA有高靈敏度和高親和力以及超低污染性。翌圣ZymeEditor™酶改造平臺(tái)將改造的具有超高活性的Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體與Protein G融合，從而獲得能精準(zhǔn)、高效切割目的蛋白附近DNA序列的pG-Tn5(Cat#14530ES)。翌圣pG-Tn5具有核酸酶殘留低、片段化能力強(qiáng)（切割活性）、建庫(kù)產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)，可用于CUT&Tag實(shí)驗(yàn)。
無核酸外切酶殘留
將1 U/5 U的pG-Tn5 Transposase分別與底物DNA在37°C下孵育4 h，瓊脂糖凝膠電泳比較DNA譜帶變化，結(jié)果顯示翌圣pG-Tn5 Transposase在5 U投入量下未檢出核酸外切酶殘留。
圖2. pG-Tn5 Transposase核酸外切酶殘留檢測(cè)
相同酶投入量下，片段化能力優(yōu)于其它品牌
分別使用翌圣及品牌A相同酶量的pG-Tn5 Transposase對(duì)200 ng gDNA進(jìn)行片段化，Agilent 2100檢測(cè)片段大小分布，結(jié)果顯示：相同酶量下，翌圣pG-Tn5 Transposase片段化效果更好，酶活性更高。
圖3. pG-Tn5 Transposase片段化能力檢測(cè)
分別使用翌圣及品牌A相同酶量的pG-Tn5 Transposase對(duì)1000個(gè)細(xì)胞投入量樣本建庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)測(cè)序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示翌圣pG-Tn5 Transposase文庫(kù)產(chǎn)量高于品牌A（圖4A），Mapping率相當(dāng)（圖4B）; 染色質(zhì)上的信號(hào)分布情況與品牌A一致（圖5）。
圖4. pG-Tn5 Transposase應(yīng)用于CUT&Tag的文庫(kù)產(chǎn)量及Mapping率
圖5. pG-Tn5 Transposase應(yīng)用于CUT&Tag在染色質(zhì)上的信號(hào)分布
應(yīng)用 | 定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
轉(zhuǎn)座酶建庫(kù)ATAC建庫(kù)
| Tn5單酶 | Tn5 Transposase | 14524ES |
建庫(kù)試劑盒 | Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®(for 50 ng) | 12207ES | |
CUT&Tag建庫(kù)
| pA-Tn5單酶 | pA-Tn5 Transposase | 14528ES |
pG-Tn5單酶 | pG-Tn5 Transposase | 14530ES | |
建庫(kù)試劑盒 | Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina | 12598ES |
參考文獻(xiàn)
[1] Dancette OP, Taboureau JL, Tournier E, et al. Purification of immunoglobulins G by protein A/G affinity membrane chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1999 Feb 19;723(1-2):61-8. doi: 10.1016/s0378-4347(98)00470-8.
[2] Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 2019 Apr 29;10(1):1930. doi: 10.1038/s41467-019-09982-5.
