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漲知識 | qPCR專場五：如何分析熒光定量數(shù)據(jù)？

2023-9-13　　閱讀(345)

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漲知識 | qPCR專場五：如何分析熒光定量數(shù)據(jù)？

 


熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生呢？

 

熒光定量PCR可以通過將Ct值轉(zhuǎn)化為數(shù)量用以計(jì)算每個(gè)PCR反應(yīng)中初始的基因靶標(biāo)數(shù)量。通常有兩種方法可以將Ct值轉(zhuǎn)化為數(shù)量，分別是絕對定量法和相對定量法。絕對定量主要用于檢測未知樣品中核酸的具體量，可通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知樣品的Ct值進(jìn)行比較實(shí)現(xiàn)定量，主要應(yīng)用于病原菌、病毒檢測等領(lǐng)域。而應(yīng)用泛的mRNA表達(dá)的研究中不需要知道具體有多少核酸量，只需要確定基因相對的表達(dá)差異，用相對定量的方法即可得到結(jié)果。相對定量是指在一定樣品中目的基因相對于另一參照樣品中量的變化，如比較樣品處理前后或不同時(shí)期目的基因的表達(dá)變化。與絕對定量相比，相對定量更簡單，應(yīng)用更普遍。

 

 

絕對定量法
 
標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的選擇
 
 
用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板的質(zhì)量對于實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒χ陵P(guān)重要。測定初始拷貝數(shù)需要盡可能均勻的純模板，常見的有DNA標(biāo)準(zhǔn)品和RNA標(biāo)準(zhǔn)品，不同的標(biāo)準(zhǔn)品有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

 

 
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
 
 
在制作曲線之前，需對模板準(zhǔn)確量化。確定模板中核酸的拷貝數(shù)，將模板按照梯度稀釋10倍，稀釋成8-10種包含不同核酸拷貝數(shù)的模板。對不同稀釋程度的模板進(jìn)行熒光定量PCR，每種模板進(jìn)行至少三次重復(fù)。由此得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線將具體拷貝數(shù)和特定的Ct值相關(guān)聯(lián)。將未知拷貝數(shù)模板熒光定量PCR后獲取的Ct值與該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可得到具體的拷貝數(shù)值。定量的準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量直接相關(guān)。

 

 

 
標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證
 
 
制作完標(biāo)準(zhǔn)曲線后，需進(jìn)行多項(xiàng)驗(yàn)證，用以確保標(biāo)準(zhǔn)曲線是有效且準(zhǔn)確的。
主要驗(yàn)證的方面如下：

  • 線性范圍和靈敏度驗(yàn)證：檢測線性范圍中的最高點(diǎn)和點(diǎn)濃度；

  • 模板質(zhì)量驗(yàn)證：分光光度計(jì)分析260/280、260/230比值；

  • 數(shù)據(jù)精度驗(yàn)證：重復(fù)組內(nèi)的Ct值差距應(yīng)≤0.5；

  • 擴(kuò)增效率驗(yàn)證：斜率盡可能接近-3.3，相當(dāng)于擴(kuò)增效率盡可能接近100%，測試前后斜率盡可能一致。

 

 

相對定量法
相對定量法中常見的是比較Ct法，其中主要包括2-ΔΔCt法，Pfaffl法和ΔCT法，目前諸多科研人員采用最多的是2-ΔΔCt法。雖然該方法應(yīng)用廣泛，但是很多人卻不了解其中的原理，例如為什么要用內(nèi)參基因的Ct值？為什么是ΔΔCt而不是ΔCt？為什么是負(fù)的ΔΔCt？接下來，小翌就為大家講解清楚。

 

 
2-ΔΔCt法講解
 
 

 

內(nèi)參基因通常是一種始終保持著低水平甲基化且一致處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的基因，高度保守且在大多數(shù)情況下持續(xù)表達(dá)，其表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小。通常在檢測基因的表達(dá)水平時(shí)用作參照物，校正操作、上樣量差異等帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

理論狀態(tài)下，PCR擴(kuò)增呈現(xiàn)指數(shù)增長，每次循環(huán)增加一倍的量，用數(shù)學(xué)表示，則為2的Ct次方。當(dāng)產(chǎn)物量到達(dá)同一水平，但對應(yīng)的Ct值不同，其原因在于初始的模板量差異。將其做比，可了解他們的模板量的差異，如下：

 

 

僅了解目的基因和內(nèi)參基因之間的初始模板量比值是難以判斷基因變化的情況(表達(dá)量變化的差異)，通常我們會選用正常組(野生型)和實(shí)驗(yàn)組來比對分析，經(jīng)過一系列處理后，研究對象對應(yīng)的目的基因表達(dá)是否受到影響。例如下方例舉的藥物測試實(shí)驗(yàn)：
 
測試一款減少黑色素表達(dá)的藥物，該藥物以灌胃的形式給藥至實(shí)驗(yàn)組小鼠，對照組小鼠僅以正常飲用水進(jìn)行灌胃，以往大量研究已表明該藥物對于黑色素表達(dá)有明顯的抑制作用。

 

 

如果研究目的基因，簡單僅以兩組的目的基因表達(dá)量相比，可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組生成黑色素的基因表達(dá)量相比于對照組要多四倍。

 

 

然而已有大量研究證明該藥物抑制黑色素表達(dá)，與已有理論存在相悖的情況。存在該情況的原因可能主要是兩組小鼠RNA提取的時(shí)候處于不同的時(shí)間、提取樣本量不一樣、cDNA上樣量不一樣、cDNA濃度不一樣等等。
 
為避免各類潛在差異帶來的影響，需引入內(nèi)參基因，可見上圖右半部分。同樣樣本，在原測試目的基因的基礎(chǔ)上，加測內(nèi)參基因。對照組得到的目的基因與內(nèi)參基因之間的模板比值為正常老鼠目的基因的比例關(guān)系，理論狀態(tài)下，以該比例×實(shí)驗(yàn)組老鼠恒定表達(dá)的內(nèi)參基因表達(dá)量即可獲得實(shí)驗(yàn)組老鼠在正常狀態(tài)下目的基因的理論表達(dá)量，實(shí)際實(shí)驗(yàn)組老鼠目的基因表達(dá)量除以理論表達(dá)值，即可計(jì)算出老鼠在藥物處理下，目的基因的表達(dá)量變化情況，具體如下：

 

 

以上結(jié)果可以得出，實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)量僅為對照組的1/2，也符合以往研究報(bào)道。
 
以上是對熒光定量數(shù)據(jù)分析得介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何分析數(shù)據(jù)已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn)，小翌會陸續(xù)在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。

 

 

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