基因編輯在免疫細(xì)胞治療中的應(yīng)用

1.基因編輯是什么？

基因編輯是通過人工核酸酶技術(shù)將靶基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行敲除，插入等精確修飾的基因工程技術(shù)。目前基因編輯已經(jīng)在多個領(lǐng)域中有著重要的應(yīng)用，在腫瘤治療中主要與免疫治療相結(jié)合，尤其在免疫細(xì)胞治療上有巨大的發(fā)展前景。

2.基因編輯的分類？

目前的基因編輯技術(shù)有可編程的核酸酶技術(shù)和BE（Base editors)及PE（Prime editors）技術(shù)（圖1）。

圖1.基因編輯技術(shù)分類[1]

可編程核酸酶主要包括鋅指核酸酶 (ZFNs) 和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶 (TALENs) 以及CRISPR-Cas核酸酶，這三種編輯方式都是將目的DNA打斷后產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB），后續(xù)依賴非同源末端連接或同源定向重組的方式進(jìn)行修復(fù)。ZFNs是最早用于哺乳動物細(xì)胞基因編輯的人工核酸酶，通過鋅指結(jié)構(gòu)域識別DNA序列并通過Fok1的二聚體對DNA進(jìn)行定點切割。ZFNs作為第一代基因編輯技術(shù)其基因修復(fù)方式多樣，對基因表達(dá)程度影響較小，但是其設(shè)計與篩選過程復(fù)雜，脫靶風(fēng)險高并且細(xì)胞毒性大。TALENs作為第二代基因編輯技術(shù)，結(jié)構(gòu)類似于ZFNs，其毒性較低且構(gòu)建容易。然而，TALENs在尺寸上比ZFNs大，組裝更加困難。后續(xù)出現(xiàn)的CRISPR-Cas核酸酶的出現(xiàn)則開啟了新的基因編輯時代。相較于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas具有良好的柔性和高效性，可以同時敲除多個基因位點，其中以CRISPR-Cas9應(yīng)用最為廣泛。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)包括Cas9蛋白和單鏈向?qū)?RNA (sgRNA)，在sgRNA的向?qū)峦ㄟ^堿基互補(bǔ)配對原則從而識別目的基因序列，并引導(dǎo)Cas9蛋白酶有效切割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂損傷后修復(fù)。

BE系統(tǒng)主要由dCas9，sgDNA和脫氨酶組成，通過對基因組 DNA中的單核苷酸轉(zhuǎn)換以實現(xiàn)精確的基因校正，無需產(chǎn)生DSB，從而克服了核酸酶的許多限制，主要包括胞嘧啶堿基編輯器 (CBE)和腺嘌呤堿基編輯器 (ABE)。PE則進(jìn)一步在BE的系統(tǒng)引入逆轉(zhuǎn)錄酶，將切口酶與逆轉(zhuǎn)錄酶偶聯(lián)在一起，實現(xiàn)單堿基的轉(zhuǎn)換，敲除以及添加等操作。堿基編輯技術(shù)具有編輯效率高、編輯損傷少等特點，但是脫氨酶的使用可能會導(dǎo)致癌變風(fēng)險的增加，而且可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)會嚴(yán)重影響編輯效率，其可靠性有待進(jìn)一步研究。

3.基因編輯在免疫細(xì)胞治療中的應(yīng)用

近年來，免疫細(xì)胞療法在治療癌癥方面表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，目前已經(jīng)有多款CAR-T療法在國內(nèi)外獲批上市，多種同種異體CAR-T療法，TCR-T細(xì)胞療法，TIL療法，CAR-NK療法也在臨床試驗中獲得佳績。第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas發(fā)展至今，目前已衍生出不同功能工具。在免疫細(xì)胞治療方面，CRISPR-Cas技術(shù)已經(jīng)被廣泛的研究并且應(yīng)用（圖2）。

圖2.CRISPR技術(shù)在T細(xì)胞治療中的應(yīng)用[2]

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以敲除供體T細(xì)胞的TCR和HLA，可以有效避免移植物抗宿主?。℅VHD）和免疫排斥反應(yīng)，該策略在開發(fā)通用型CAR-T細(xì)胞中已被廣泛應(yīng)用。除此之外，CRISPR-Cas9技術(shù)可以通過敲除免疫檢查點（如PD-1，CTLA-4，TIM-3等）以及一些抑制性信號通路分子（如AAR2，TGFBR2，DGKs等），以提高T細(xì)胞在腫瘤免疫抑制微環(huán)境中的持久性，并增強(qiáng)其抗癌活性[2]。在TCR-T治療中，CRISPR基因編輯系統(tǒng)還可以用于敲除內(nèi)源性的TCRα和β基因，減少內(nèi)源性TCR的錯配，從而改善TCR-T細(xì)胞療法的抗癌活性，并且其安全性也在臨床實驗中得到驗證。目前Stadtmauer教授團(tuán)隊使用CRISPR技術(shù)同時敲除TRAC, TRBC 和PDCD1三個基因，再通過慢病毒將NY-ESO-1 TCR轉(zhuǎn)至T細(xì)胞中，這種生成的靶向NY-ESO-1抗原的TCR-T細(xì)胞療法在３名患者中表現(xiàn)出良好的安全性[3]。

CRISPR技術(shù)還可以通過同源重組的方式將帶有CAR基因的模板DNA特異性的插入至特定的基因位點，無需使用傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄或者慢病毒載體，減少基因整合的風(fēng)險。Justin Eyquem將靶向CD19的CAR通過CRISPR/Cas9定向插入T細(xì)胞的TRAC位點，可以有效調(diào)控CAR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并減緩T細(xì)胞的分化和衰竭，增加T細(xì)胞治療效力[4]。除了Cas9外，Cas12a/Cpf1也是腫瘤免疫細(xì)胞療法的有力工具。Cpf1作為一種不需要tracrRNA的crRNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，可以同時對多個基因進(jìn)行編輯；與Cas9相比，Cpf1的脫靶率低；同時切割產(chǎn)生的粘性末端，讓DNA插入更可控。陳斯迪教授課題組人員通過Cpf1-AAV系統(tǒng)，實現(xiàn)了HDR介導(dǎo)的雙CAR敲入和免疫檢查點基因敲除（圖3）。相比于Cas9制備的CAR-T細(xì)胞，AAV-Cpf1 KIKO的CAR-T細(xì)胞有著更強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞能力，同時PD-1等耗竭型標(biāo)志物的表達(dá)水平更低[5]。2023年，該團(tuán)隊該開發(fā)了一個基于CRISPR的高效、高通量基因敲入平臺——CLASH，通過腺相關(guān)病毒（AAV）文庫編碼大量同源重組修復(fù)模板，結(jié)合CRISPR-Cas12a的mRNA，從而實現(xiàn)大規(guī)模長鏈基因片段的精準(zhǔn)敲入[6]。

圖3.AAV-cpf1介導(dǎo)的多重基因編輯流程[5]

近年來，除了健康供體外周血來源的PBMC外，iPSC在基因編輯技術(shù)的加持下，已逐漸發(fā)展為通用型細(xì)胞藥物的細(xì)胞來源之一。Fate Therapeutics公司的細(xì)胞藥物FT819，通過基因編輯將靶向CD19的新型CAR插入T細(xì)胞受體α基因座位點，進(jìn)而分化產(chǎn)生不受患者限制的iPSC來源的通用CAR-T細(xì)胞（圖4）。除了CAR-iT外，F(xiàn)ate還運用iPSCs解決NK細(xì)胞來源問題，從而規(guī)避外周血NK細(xì)胞數(shù)量不足和臍帶血NK細(xì)胞的倫理等風(fēng)險，通過敲除內(nèi)源性CD38提高NK細(xì)胞的適應(yīng)性并特異性預(yù)防CD38單抗介導(dǎo)的自相殘殺（圖5）。同時有研究發(fā)現(xiàn)，用基因編輯敲除iPSC來源的NK細(xì)胞的CISH基因，能夠使NK細(xì)胞代謝重編程，并其在體內(nèi)的持久性和抗腫瘤活性[7]。

圖4 . FT819結(jié)構(gòu)

圖5 . FT522結(jié)構(gòu)

CRISPR基因編輯系統(tǒng)作為一種強(qiáng)而有力的工具，還可以通過與高通量測序技術(shù)聯(lián)用，篩選能夠提高免疫療法療效的基因靶點，目前已經(jīng)有多項研究發(fā)現(xiàn)了新的T細(xì)胞激活調(diào)節(jié)因子，T細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)因子，以及抗原處理/呈遞通路和干擾素通路中的創(chuàng)新靶點[8]（圖6）。西湖大學(xué)謝琦團(tuán)隊利用基于CRISPR 基因編輯系統(tǒng)的全基因組功能缺失性文庫分別對于CAR-T細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GBM中惡性程度最高的細(xì)胞群）進(jìn)行高通量無偏向的篩選，發(fā)現(xiàn)了多個能顯著提高靶向GBM的CAR T細(xì)胞抗腫瘤效力的新靶點[9]。除此之外，研發(fā)人員基于CRISPR-Cas9開發(fā)出同源定向誘變（HDM）技術(shù)用于CAR序列的高通量的篩選[10]。

圖6.SLICE篩選平臺[8]

4.基因編輯在免疫細(xì)胞治療中的挑戰(zhàn)

盡管基因編輯在提高免疫細(xì)胞治療效果方面顯示出巨大的潛力，但是由于其安全性和有效性等問題在一定程度上影響其向臨床轉(zhuǎn)化。

首先，對于基因編輯策略而言, 最大的擔(dān)憂是潛在的脫靶毒性，一旦發(fā)生脫靶，將導(dǎo)致非靶標(biāo)基因的改變或調(diào)控元件的破壞，會造成不可逆轉(zhuǎn)的后果。盡管利用預(yù)測軟件能夠分析出潛在脫靶位點, 但是在一些非典型PAM位點或者與靶點相似度較低位點仍然有可能有脫靶現(xiàn)象發(fā)生。同時，全基因組測序分析對于概率極低的脫靶現(xiàn)象也很有可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。近年來, 許多靈敏度的體內(nèi)、體外實驗方法被開發(fā)出來例如GUIDE-Seq, CIRCLE-seq, CHANGE-Seq等以幫助檢測潛在的低頻脫靶位點。新型基因編輯系統(tǒng)例如PE以及BE編輯系統(tǒng)也逐漸應(yīng)用于免疫細(xì)胞治療中。這些方法在免疫細(xì)胞治療中的合理運用將會對臨床實驗的安全性起到重要的作用。

同時以過繼性細(xì)胞治療為基礎(chǔ)的腫瘤免疫細(xì)胞治療，主要包括CAR-T細(xì)胞、TCR-T細(xì)胞和CAR-NK細(xì)胞治療等，均需要足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞保證其臨床療效。目前大多數(shù)基于CRISPR/Cas技術(shù)編輯的T細(xì)胞都是通過電穿孔的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是該方法對細(xì)胞損傷較大，致使細(xì)胞的活力下降并阻礙其體外增殖。因此，其他更安全、更高效的傳遞途徑亟待探索。

參考文獻(xiàn)

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7.Zhu H. et al. Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity. Cell Stem Cell. 2020 Aug 6;27(2):224-237.
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9.Wang D. et al. CRISPR Screening of CAR T Cells and Cancer Stem Cells Reveals Critical Dependencies for Cell-Based Therapies. Cancer Discov. 2021 May;11(5):1192-1211.
10.Parola C. et al. Antibody discovery and engineering by enhanced CRISPR-Cas9 integration of variable gene cassette libraries in mammalian cells. MAbs. 2019 Nov-Dec;11(8):1367-1380.

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