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尿嘧啶特異性切除試劑（Uracil-Specific Excision Reagent , USER）是由尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase, UDG）和核酸內(nèi)切酶 Ⅷ(Endonuclease VIII, Endo Ⅷ)（戳鏈接了解詳情）兩種酶混合而成。UDG識別ssDNA或dsDNA上的dU堿基并形成AP位點，但磷酸二酯骨架結(jié)構保持完整。Endo VIII的裂解酶活性能夠使AP位點的3′和5′端的磷酸二酯鍵斷裂，釋放無堿基的脫氧核糖，形成單核苷酸間隙。因此，USER酶混合物能在DNA的dU位置產(chǎn)生一個單核苷酸缺口，適用于ssDNA、dsDNA及環(huán)狀DNA，可應用于
RNA鏈特異性文庫構建；
尿嘧啶特異性刪除介導的克?。║SER-LIC）；
TALE基本單位的組裝；
單細胞多個cDNA串聯(lián)建庫。
圖1. 切除dUTP示意圖
Uracil-Specific Excision Reagent的應用
RNA鏈特異性文庫構建
技術路線：
使用引物合成RNA對應的cDNA第一鏈；
使用dUTP取代dTTP合成cDNA的第二條鏈；
末端修復、3’加A、接頭連接；
去除含dUTP的cDNA鏈：用USER酶混合物處理，將含有dUTP的cDNA鏈去除，留下cDNA一條反鏈；
PCR 擴增，上機測序。
圖2. 常規(guī)RNA建庫與鏈特異性文庫構建對比[1]
尿嘧啶特異性刪除介導的克?。║SER-LIC）
技術路線：
擴增：用含dUTP的引物擴增目的片段和載體；
切除dUTP：將得到的兩種線性片段用USER酶混合物處理，使它們暴露互補的粘性末端；
連接與轉(zhuǎn)化：將帶有互補粘性末端的兩種線性片段混合后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)過篩選獲得目標質(zhì)粒。
圖3. 克隆示意圖[2]
助力TALE技術，構建TALE基本單位
技術路線：
擴增：使用含有dUTP的引物擴增每個特定的TALE基本單位的編碼基因；
切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在每個基本單位的編碼基因DNA兩端保留一段特定的粘性末端；
組裝：這些粘性末端按照預先設計的順序排列，以確保所有基本單位按順序組裝連接成最終靶向特定序列的TALE工具。
圖4. 基于尿嘧啶切除克隆的TALE組裝示意圖[3]
助力HIT-scISOseq技術，將單細胞多個cDNA串聯(lián)建庫
技術路線：
獲得單細胞cDNA：借助10X Genomics 平臺，獲得單細胞全長cDNA；
擴增cDNA：利用生物素化的含dUTP的PCR引物對全長cDNA進行擴增；
捕獲cDNA：然后使用鏈霉親和素珠捕獲擴增的生物素化的cDNA；
切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在cDNA的兩個末端產(chǎn)生粘性末端；
連接與測序：使用DNA連接酶連接多個cDNA構建CCS文庫后進行長讀長測序。
圖5. HIT-scISOseq單細胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的技術流程[4]
翌圣Uracil-Specific Excision Reagent
數(shù)據(jù)展示
dUTP切除效果與進口品牌N*一致
圖6. dUTP切除效果對比圖
USER-LIC效果優(yōu)于進口品牌N*
圖7. 菌落數(shù)對比
客戶反饋
圖8. qPCR擴增曲線
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應用 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
dUTP切除，USER-LIC，RNA鏈特異性建庫 | Uracil-Specific Excision Reagent(1 U/μL) | 14537ES |
DNA損傷修復研究 | Endonuclease VIII (10 U/μL) | 14536ES |
PCR防污染 | Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), 1 U/μL | 14455ES |
參考文獻
