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關(guān)于USER酶混合物的應(yīng)用，看這篇就夠了！
2023-11-5 閱讀(483)
尿嘧啶特異性切除試劑（Uracil-Specific Excision Reagent , USER）是由尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase, UDG）和核酸內(nèi)切酶 Ⅷ(Endonuclease VIII, Endo Ⅷ)（戳鏈接了解詳情）兩種酶混合而成。UDG識別ssDNA或dsDNA上的dU堿基并形成AP位點，但磷酸二酯骨架結(jié)構(gòu)保持完整。Endo VIII的裂解酶活性能夠使AP位點的3′和5′端的磷酸二酯鍵斷裂，釋放無堿基的脫氧核糖，形成單核苷酸間隙。因此，USER酶混合物能在DNA的dU位置產(chǎn)生一個單核苷酸缺口，適用于ssDNA、dsDNA及環(huán)狀DNA，可應(yīng)用于
RNA鏈特異性文庫構(gòu)建；
尿嘧啶特異性刪除介導的克?。║SER-LIC）；
TALE基本單位的組裝；
單細胞多個cDNA串聯(lián)建庫。
圖1. 切除dUTP示意圖
Uracil-Specific Excision Reagent的應(yīng)用
RNA測序（RNA-seq）已成為全轉(zhuǎn)錄組水平研究差異基因表達和mRNA差異剪接的工具，具有更準確、可重復、廣泛和可靠的特點。RNA-seq的基本流程包括：提取RNA、建立cDNA文庫、上機擴增測序、數(shù)據(jù)分析。其中RNA-seq文庫構(gòu)建包括常規(guī)建庫和RNA鏈特異性建庫兩種方法。在常規(guī)mRN建庫的流程中，由于我們在雙鏈cDNA的兩端加上的接頭是對稱的，這樣得到的文庫在測序后，無法判斷測出來的reads是來自正鏈還是負鏈。為了避免普通RNA-seq無法區(qū)分轉(zhuǎn)錄本方向的問題，后來出現(xiàn)了鏈特異的文庫構(gòu)建方法。鏈特異性RNA-seq保留了轉(zhuǎn)錄本的方向信息，可以確定reads是來源于正鏈或負鏈，使得基因定量和可變剪切事件檢測更準確。如圖2所示，利用dUTP標記cDNA二鏈，USER酶混合物使標記鏈被降解，可以實現(xiàn)鏈特異性RNA-seq文庫構(gòu)建。
使用引物合成RNA對應(yīng)的cDNA第一鏈；
去除含dUTP的cDNA鏈：用USER酶混合物處理，將含有dUTP的cDNA鏈去除，留下cDNA一條反鏈；
圖2. 常規(guī)RNA建庫與鏈特異性文庫構(gòu)建對比[1]
USER-LIC是一種不依賴限制酶切位點，實現(xiàn)無痕克隆以及多片段同時組裝的新型體外重組克隆。USER-LIC主要是通過USER酶混合物特異性識別和刪除擴增的雙鏈DNA片段中的dUTP，從而實現(xiàn)重疊DNA序列長度的可控。
切除dUTP：將得到的兩種線性片段用USER酶混合物處理，使它們暴露互補的粘性末端；
連接與轉(zhuǎn)化：將帶有互補粘性末端的兩種線性片段混合后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)過篩選獲得目標質(zhì)粒。
圖3. 克隆示意圖[2]
助力TALE技術(shù)，構(gòu)建TALE基本單位
TALE技術(shù)（Transcription activator-like effector , TALE）是一種熱門的基因編輯工具，能夠精準編輯DNA。TALE的基本單位是一個可以識別不同堿基的蛋白domain，一個domain可以識別一個堿基，所以要構(gòu)建一個識別多個連續(xù)DNA堿基的TALE就需要多個對應(yīng)的基本蛋白domain。使用USER-LIC的方法，可以高效地合成這些基本單元，然后將它們有序組裝成最終的TALE工具。這種技術(shù)在低脫靶率等方面具有優(yōu)勢，被廣泛用于各種基因編輯工具的開發(fā)。
擴增：使用含有dUTP的引物擴增每個特定的TALE基本單位的編碼基因；
切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在每個基本單位的編碼基因DNA兩端保留一段特定的粘性末端；
組裝：這些粘性末端按照預(yù)先設(shè)計的順序排列，以確保所有基本單位按順序組裝連接成最終靶向特定序列的TALE工具。
圖4. 基于尿嘧啶切除克隆的TALE組裝示意圖[3]
助力HIT-scISOseq技術(shù)，將單細胞多個cDNA串聯(lián)建庫
HIT-scISOseq技術(shù)由華大基因唐沖博士團隊和中山大學眼科中心眼科國家重點實驗室劉奕志院長團隊共同開發(fā)，該技術(shù)利用USER酶混合物在cDNA兩個末端產(chǎn)生粘性末端，從而實現(xiàn)單細胞多個cDNA串聯(lián)建庫，結(jié)合PacBio平臺（CCS）測序，以實現(xiàn)高通量和高精度的單細胞RNA亞型測序研究。
技術(shù)路線：
獲得單細胞cDNA：借助10X Genomics 平臺，獲得單細胞全長cDNA；
擴增cDNA：利用生物素化的含dUTP的PCR引物對全長cDNA進行擴增；
捕獲cDNA：然后使用鏈霉親和素珠捕獲擴增的生物素化的cDNA；
切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在cDNA的兩個末端產(chǎn)生粘性末端；
連接與測序：使用DNA連接酶連接多個cDNA構(gòu)建CCS文庫后進行長讀長測序。
圖5. HIT-scISOseq單細胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的技術(shù)流程[4]
翌圣Uracil-Specific Excision Reagent
翌圣Uracil-Specific Excision Reagent（Cat#14537ES）由翌圣生物分子酶改造平臺———ZymeEditor™經(jīng)過重組表達獲得的Endo VIII（Cat#14536ES）與UDG（Cat#14455ES）的混合酶，無核酸酶、RNase殘留，低宿主殘留，適用于dUTP切除、USER-LIC、RNA鏈特異性建庫以及單細胞cDNA串聯(lián)建庫等領(lǐng)域。
分別使用翌圣的Uracil-Specific Excision Reagent（1 U/μL）與進口品牌N*的同類產(chǎn)品（1 U/μL）切除10 pmol含dUTP的雙鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，翌圣Uracil-Specific Excision Reagent與進口品牌N*的切除效果一致。
圖6. dUTP切除效果對比圖
分別使用翌圣的Uracil-Specific Excision Reagent（1 U/μL）和進口品牌N*的同類產(chǎn)品（1 U/μL）連接600bp DNA片段構(gòu)建載體，并導入到大腸桿菌中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)，結(jié)果表明，翌圣Uracil-Specific Excision Reagent應(yīng)用于USER-LIC效果優(yōu)于進口品牌N*。
圖7. 菌落數(shù)對比
客戶測試翌圣14537ES與進口品牌N*的RNA鏈特異性建庫性能，擴增曲線表明翌圣Uracil-Specific Excision Reagent與進口品牌N*的RNA鏈特異性建庫性能一致。
圖8. qPCR擴增曲線
應(yīng)用 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
dUTP切除，USER-LIC，RNA鏈特異性建庫 | Uracil-Specific Excision Reagent(1 U/μL) | 14537ES |
DNA損傷修復研究 | Endonuclease VIII (10 U/μL) | 14536ES |
PCR防污染 | Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), 1 U/μL | 14455ES |
[1] Zhao S, Zhang Y, Gordon W, et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 2015 Sep 3;16(1):675. doi: 10.1186/s12864-015-1876-7.[2] Annaluru N, Muller H, Ramalingam S, Kandavelou K, London V, Richardson SM, Dymond JS, Cooper EM, Bader JS, Boeke JD, Chandrasegaran S. Assembling DNA fragments by USER fusion. Methods Mol Biol. 2012;852:77-95. doi: 10.1007/978-1-61779-564-0_7. PMID: 22328427.[3] Zhou J, Wang J, Chen F, Zhuang Z, Chen M, Yang Y, Luo X, Tang C, Zhou X, Chi Y, Wang J, He Y, Zhang K, Zou Q. Improved USER cloning for TALE assembly and its application to base editing. PLoS One. 2023 Aug 4;18(8):e0289509. doi: 10.1371/journal.pone.0289509. [4] Shi, ZX., Chen, ZC., Zhong, JY. et al. High-throughput and high-accuracy single-cell RNA isoform analysis using PacBio circular consensus sequencing. Nat Commun 14, 2631 (2023).
