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尿嘧啶特異性切除試劑（Uracil-Specific Excision Reagent , USER）是由尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase, UDG）和核酸內(nèi)切酶 Ⅷ(Endonuclease VIII, Endo Ⅷ)（戳鏈接了解詳情）兩種酶混合而成。UDG識(shí)別ssDNA或dsDNA上的dU堿基并形成AP位點(diǎn)，但磷酸二酯骨架結(jié)構(gòu)保持完整。Endo VIII的裂解酶活性能夠使AP位點(diǎn)的3′和5′端的磷酸二酯鍵斷裂，釋放無(wú)堿基的脫氧核糖，形成單核苷酸間隙。因此，USER酶混合物能在DNA的dU位置產(chǎn)生一個(gè)單核苷酸缺口，適用于ssDNA、dsDNA及環(huán)狀DNA，可應(yīng)用于
RNA鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建；
尿嘧啶特異性刪除介導(dǎo)的克?。║SER-LIC）；
TALE基本單位的組裝；
單細(xì)胞多個(gè)cDNA串聯(lián)建庫(kù)。
圖1. 切除dUTP示意圖
Uracil-Specific Excision Reagent的應(yīng)用
RNA鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建
技術(shù)路線：
使用引物合成RNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈；
使用dUTP取代dTTP合成cDNA的第二條鏈；
末端修復(fù)、3’加A、接頭連接；
去除含dUTP的cDNA鏈：用USER酶混合物處理，將含有dUTP的cDNA鏈去除，留下cDNA一條反鏈；
PCR 擴(kuò)增，上機(jī)測(cè)序。
圖2. 常規(guī)RNA建庫(kù)與鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建對(duì)比[1]
尿嘧啶特異性刪除介導(dǎo)的克隆（USER-LIC）
技術(shù)路線：
擴(kuò)增：用含dUTP的引物擴(kuò)增目的片段和載體；
切除dUTP：將得到的兩種線性片段用USER酶混合物處理，使它們暴露互補(bǔ)的粘性末端；
連接與轉(zhuǎn)化：將帶有互補(bǔ)粘性末端的兩種線性片段混合后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)篩選獲得目標(biāo)質(zhì)粒。
圖3. 克隆示意圖[2]
助力TALE技術(shù)，構(gòu)建TALE基本單位
技術(shù)路線：
擴(kuò)增：使用含有dUTP的引物擴(kuò)增每個(gè)特定的TALE基本單位的編碼基因；
切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在每個(gè)基本單位的編碼基因DNA兩端保留一段特定的粘性末端；
組裝：這些粘性末端按照預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列，以確保所有基本單位按順序組裝連接成最終靶向特定序列的TALE工具。
圖4. 基于尿嘧啶切除克隆的TALE組裝示意圖[3]
助力HIT-scISOseq技術(shù)，將單細(xì)胞多個(gè)cDNA串聯(lián)建庫(kù)
技術(shù)路線：
獲得單細(xì)胞cDNA：借助10X Genomics 平臺(tái)，獲得單細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA；
擴(kuò)增cDNA：利用生物素化的含dUTP的PCR引物對(duì)全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增；
捕獲cDNA：然后使用鏈霉親和素珠捕獲擴(kuò)增的生物素化的cDNA；
切除dUTP：使用USER酶混合物切除dUTP，在cDNA的兩個(gè)末端產(chǎn)生粘性末端；
連接與測(cè)序：使用DNA連接酶連接多個(gè)cDNA構(gòu)建CCS文庫(kù)后進(jìn)行長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序。
圖5. HIT-scISOseq單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的技術(shù)流程[4]
翌圣Uracil-Specific Excision Reagent
數(shù)據(jù)展示
dUTP切除效果與進(jìn)口品牌N*一致
圖6. dUTP切除效果對(duì)比圖
USER-LIC效果優(yōu)于進(jìn)口品牌N*
圖7. 菌落數(shù)對(duì)比
客戶反饋
圖8. qPCR擴(kuò)增曲線
相關(guān)產(chǎn)品推薦
應(yīng)用 | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品貨號(hào) |
dUTP切除，USER-LIC，RNA鏈特異性建庫(kù) | Uracil-Specific Excision Reagent(1 U/μL) | 14537ES |
DNA損傷修復(fù)研究 | Endonuclease VIII (10 U/μL) | 14536ES |
PCR防污染 | Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), 1 U/μL | 14455ES |
參考文獻(xiàn)
