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克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)"，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆"，即通過(guò)重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái)，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無(wú)縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟。其中，載體和片段連接的方法是分子克隆的核心步驟，接下來(lái)小翌就具體解析一下載體和片段連接的過(guò)程，為您的實(shí)驗(yàn)提供好方法。
根據(jù)市面上主要的分子克隆技術(shù)，載體與片段的連接過(guò)程可分為依賴連接酶的連接、依賴修飾酶的連接以及依賴重組酶的連接。
依賴連接酶的連接
DNA連接酶是一種能夠封閉DNA鏈上缺囗的酶，它借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-磷酸基端與另一DNA鏈的3'-羥基端生成磷酸二酯鍵。根據(jù)酶的腺苷?；蕾嚥煌煞譃椴煌倪B接酶：依賴NAD的連接酶和依賴ATP的連接酶。最早發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都依賴NAD水解提供能量，直到1970年發(fā)現(xiàn)能借助ATP提供能量的DNA連接酶——T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase，T4 Lig），由病毒基因組編碼而成，主要從缺失型噬菌體中提取，噬菌體T4的30基因是該酶的合成基因。該連接酶應(yīng)用最為廣泛，如翌圣T4 DNA連接酶（Cat#10300ES）。
連接反應(yīng)由三步完成：
T4 DNA ligase先由ATP供能產(chǎn)生E-AMP復(fù)合物；
E-AMP復(fù)合物識(shí)別雙鏈DNA切口位置，將AMP轉(zhuǎn)移到5'-P基團(tuán)，形成5'-P-AMP復(fù)合物；
3'-OH親核攻擊5'-P-AMP形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。
圖1. T4 DNA連接酶的作用原理【1】
利用目前已知的T4連接酶的連接特點(diǎn)，在具體的基因工程操作中，科研人員對(duì)DNA片段的連接方法分為以下三種：
連接dsDNA的粘性末端
用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，形成具有黏性末端的DNA片段，利用DNA連接酶直接連接；
圖2. 粘性末端酶切連接
連接平末端
對(duì)于平末端的DNA片段的連接常利用T4 DNA連接酶連接；
連接人為合成的粘性末端
在DNA片段末端加上poly（dA）-poly（dT）尾，或化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成黏性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái)。如翌圣普通PCR試劑盒（Cat#10102ES、Cat#10103ES、Cat#10157ES）等，含有Hieff® Taq DNA Polymerase（Cat#10101ES），使得擴(kuò)增產(chǎn)物末端具有3’-dA，可通過(guò)T4連接酶直接用于TA克隆或者NGS接頭連接。
圖3. NGS文庫(kù)構(gòu)建中接頭的連接
依賴修飾酶的連接
這類連接技術(shù)不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制，而是通過(guò)DNA修飾酶進(jìn)行載體和片段的連接。該技術(shù)克服了低連接效率和受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)限制的問(wèn)題，使得基因克隆更加靈活，更具有可操控性。
Aslanidis和de Jong于1990年提出不需要限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的克隆連接法，即利用T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切活性，切割片段和載體，產(chǎn)生12個(gè)堿基的5'突出互補(bǔ)末端，利用突出的互補(bǔ)末端之間的退火復(fù)性進(jìn)行基因連接。
圖4. 不依賴連接反應(yīng)的克隆法【4】
其中，拓?fù)洚悩?gòu)酶是被研究得最詳細(xì)的DNA修飾酶，它分為拓?fù)洚悩?gòu)酶I和拓?fù)洚悩?gòu)酶II。拓?fù)洚悩?gòu)酶I催化DNA單鏈的斷裂和重新連接，不需要能量輔助因子如ATP或NAD。拓?fù)洚悩?gòu)酶II能同時(shí)斷裂并連接DNA雙鏈，通常需要能量輔助因子ATP。
翌圣TOPO克隆試劑盒（Cat#10906ES、Cat#10907ES、Cat#10909ES），含有拓?fù)洚悩?gòu)酶，該酶通過(guò)磷酸鍵偶聯(lián)在TOPO載體的兩端，在連接反應(yīng)中，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團(tuán)連接在一起，Topo異構(gòu)酶從載體分子上脫落，僅需5 min就能完成連接反應(yīng)。
依賴重組酶的連接
重組酶最早應(yīng)用于Gateway技術(shù)中，它能夠識(shí)別、切割特異的重組位點(diǎn)，并連接兩個(gè)參與重組的載體和片段。目前應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)是Gibson Assembly，原理是通過(guò)外切酶產(chǎn)生黏性末端，再通過(guò)同源重組酶的連接得到重組片段。
翌圣同源重組克隆試劑盒（Cat#10911ES、Cat#10922ES），預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了的重組增強(qiáng)因子，可顯著提高重組克隆效率。通過(guò)PCR產(chǎn)物兩端便分別帶上15-20個(gè)與載體序列同源性的堿基，依靠堿基間作用力互補(bǔ)配對(duì)成環(huán)，不經(jīng)過(guò)酶切，PCR產(chǎn)物和線性化載體在同源重組酶的作用下，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間和溫度即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。
圖5. 同源重組原理
通過(guò)連接反應(yīng)，目的片段和載體已連接組合在一起，成為新的重組DNA質(zhì)粒。為了表達(dá)克隆的目的基因片段，需要將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌等細(xì)胞中，即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)——轉(zhuǎn)化。那么轉(zhuǎn)化步驟中應(yīng)用到的技術(shù)和試劑又有哪些呢？關(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解轉(zhuǎn)化技術(shù)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)新的思路與方向，期待下一次的見面~
相關(guān)產(chǎn)品列表
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
T4連接 | Hieff® Gold T4 DNA Ligase | 10300ES80 | 1000 U |
快速PCR，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規(guī)PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規(guī)PCR，不含染料 | 2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) | 10103ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
兼容TA/平末端克隆 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES08/20 | 5 T/20 T |
TOPO克隆-TA末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES20 | 20 T |
TOPO克隆-平末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit | 10909ES20 | 20 T |
單片段一步克隆，已發(fā)文章累計(jì)IF達(dá)到1000+ | Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 | 10911ES20/50 | 20 T/50 T |
1-6片段一步克隆，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒 | 10922ES20/50 | 20 T/50 T |
參考文獻(xiàn)
1.Lohman G J S , Chen L , Evans T C . Kinetic Characterization of Single Strand Break Ligation in Duplex DNA by T4 DNA Ligase[J]. Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(51):44187-44196.
2.Anderson HJ, Roberge M. DNA topoisomerase II: a review of its involvement in chromosome structure, DNA replication, transcription and mitosis. Cell Biol Int Rep 1992; 16(8): 717–724.
3.Kunze N, Yang GC, Dolberg M, Sundarp R, Knippers R, Richter A. Structure of the human type I DNA topoisomerase gene. J Biol Chem 1991; 266(15): 9610–9616.
4.Aslanidis C, de Jong PJ. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res, 1990, 18(20): 6069-6073.
