拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase) 是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一類酶，它們能夠切斷單鏈或雙鏈DNA的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來更正DNA連環(huán)數(shù)，從而控制DNA的拓?fù)錉顟B(tài)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶分為兩類，I型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA Topoisomerase I）和II型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA Topoisomerase II）。Topoisomerase I是由美國(guó)科學(xué)家Stewart Shuman在1990年從牛痘病毒中發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)具有限制性內(nèi)切酶活性和連接酶活性，能夠在DNA復(fù)制過程中切斷并重新連接DNA。Topoisomerase I可以在無需ATP供能的情況下切斷DNA鏈，在切割單鏈DNA后，會(huì)與末端DNA片段形成暫時(shí)性中間體，并在釋放壓力后重新連接切口。由于Topoisomerase I具有切斷、連接DNA的這種特性，常被用于克隆載體的構(gòu)建（如TOPO克隆）以及NGS 建庫(kù)中的接頭連接等。
圖1. Topoisomerase I原理圖[1]
TOPO克隆是一種基于Topoisomerase I的PCR產(chǎn)物快速克隆系統(tǒng)，利用Topoisomerase I的連接原理，無需DNA連接酶，可在5 min內(nèi)高效連接DNA片段。Topoisomerase I識(shí)別并切割TOPO載體上的結(jié)合位點(diǎn)，切割完成后，與TOPO載體結(jié)合形成復(fù)合物。目的DNA片段可在Topoisomerase I的作用下與TOPO載體連接，形成克隆。識(shí)別切割：Topoisomerase I識(shí)別DNA序列5’-(C/T)CCTT-3’，并且能夠在該位點(diǎn)對(duì)DNA進(jìn)行切割；
固定：Topoisomerase I借助DNA斷裂的能量將酪氨酸殘基與載體DNA 3’末端形成共價(jià)鍵，從而固定在DNA載體上；
連接：在加入目的DNA片段（PCR Product）后，目的DNA片段的5'端羥基攻擊載體片段的磷酸鍵，釋放能量，使得目的DNA片段的 5'端羥基與載體片段的3'端磷酸基團(tuán)連接在一起；
脫落：Topoisomerase I從載體分子上脫落。
圖2. TOPO原理圖
翌圣Topoisomerase I (Cat#14971ES)由翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor酶進(jìn)化平臺(tái)經(jīng)過重組表達(dá)獲得，無外切酶殘留、低宿主殘留，可應(yīng)用于NGS 建庫(kù)中的接頭連接、TOPO克隆等！
應(yīng)用到TOPO克隆，克隆效果優(yōu)于A品牌
使用不同批次的Topoisomerase I進(jìn)行TOPO克隆，分別連接2 kb的粘性末端、4 kb的平末端，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，翌圣Topoisomerase I運(yùn)用到TOPO克隆中，克隆效果優(yōu)于A品牌，陽性克隆率達(dá)100%（8/8）。
圖3. Topoisomerase I運(yùn)用到TOPO克隆效果圖
將50 U不同批次的Topoisomerase I分別與相應(yīng)的底物DNA在37℃孵育4 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，翌圣Topoisomerase I無外切酶殘留。
圖4. 外切酶殘留檢測(cè)
E. coli基因組DNA殘留< 1 copy/5U
對(duì)不同批次的Topoisomerase I (Cat#14971ES)進(jìn)行E. coli基因組DNA殘留檢測(cè)，結(jié)果顯示翌圣Topoisomerase I宿主基因組DNA殘留遠(yuǎn)低于1 copy/5U。
圖5. E. coli基因組DNA殘留檢測(cè)
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品規(guī)格 |
Topoisomerase I | 14971ES | 100 / 500 U |
初級(jí)會(huì)員·13年
