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克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)"，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆"，即通過(guò)重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái)，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無(wú)縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟。因?yàn)椴襟E較多且知識(shí)點(diǎn)復(fù)雜，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中就會(huì)遇到各種各種的問題，尤其是各位科研兒們運(yùn)用最多的同源重組技術(shù)。接下來(lái)小翌會(huì)具體解答一下同源重組中常見的問題，為您的實(shí)驗(yàn)提供好方法。
一步法快速克隆試劑盒運(yùn)用到的分子克隆技術(shù)是什么？
外切酶活性：該酶能特異性地識(shí)別載體和插入片段末端的15-25 bp的同源序列，并沿著5';→3';方向切割dsDNA，從而產(chǎn)生粘性末端，粘性末端的堿基在50℃作用下進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，將具備同源序列的載體與插入片段“融合"。 DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保證將片段和載體的5’末端都降解成一樣長(zhǎng)的粘性末端，同源末端退火配對(duì)后，還存在單鏈的堿基缺口。故需要借助DNA聚合酶活性進(jìn)行修復(fù)。 連接酶活性：催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口縫合。
圖1.同源重組原理
與傳統(tǒng)分子克隆相比，一步法快速克隆試劑盒有什么優(yōu)勢(shì)？
應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結(jié)合Canace高保真酶，應(yīng)用于定點(diǎn)突變；
設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單：在插入片段的PCR擴(kuò)增引物5’端引入15-25 bp與載體末端同源的序列即可。
一步法克隆試劑盒連接反應(yīng)總體系20 μL，但載體/片段濃度低可否使用小體系連接？
超短片段高效率重組
多片段高效率重組
一步法克隆連接后無(wú)陽(yáng)性克隆或者菌落數(shù)少，是什么原因造成的，該怎么解決呢？
出現(xiàn)問題 | 原因分析 | 解決方法 |
無(wú)克隆長(zhǎng)出或克隆數(shù)較少？ | 原因1：引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤 | ①設(shè)計(jì)原則：同源臂（15-25bp，GC含量40-60%）+酶切位點(diǎn)(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求保留或刪除)+基因特異性引物（常規(guī)插入片段擴(kuò)增引物）。 ②判斷方法：使用翌圣無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件核對(duì) |
原因2：線性化載體與目的片段使用量錯(cuò)誤 | 線性化載體與目的片段添加比例：最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，最適載體使用量為0.03 pmol；最適目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。 注：a、片段長(zhǎng)度大于載體時(shí)，最適載體與目的片段使用量的計(jì)算方式應(yīng)互換，即目的片段當(dāng)做載體，載體當(dāng)做目的片段進(jìn)行計(jì)算。 b、線性化載體的使用量應(yīng)在50-200ng之間；目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量應(yīng)在20-200ng之間。當(dāng)使用上述公式計(jì)算最適使用量超出這個(gè)范圍時(shí)，則選擇或最高使用量即可。 | |
原因3：載體與目的片段不純 | 推薦對(duì)線性化載體、PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。重組反應(yīng)體系中應(yīng)盡量避免金屬絡(luò)合劑（如EDTA）的帶入，故DNA純化產(chǎn)物不能使用TE進(jìn)行DNA保存，可溶解在pH8.0的ddH2O中保存。未純化DNA加入重組反應(yīng)體系內(nèi)的總體積不應(yīng)超過(guò)反應(yīng)體系體積1/5。 | |
原因4：操作問題或試劑盒失效 | 推薦做試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若陽(yáng)性對(duì)照有克隆并檢測(cè)為陽(yáng)性，則排除試劑盒問題。若陽(yáng)性對(duì)照無(wú)克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步排除是否為操作問題。 | |
原因5：感受態(tài)細(xì)胞效率低，＜107cfu/μg | 轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)方法：轉(zhuǎn)化0.1ng質(zhì)粒（如PUC19），生長(zhǎng)1000個(gè)菌斑，估算轉(zhuǎn)化效率為107cfu/μg。 | |
假陽(yáng)性—不含插入片段（空載）？ | 原因1：載體線性化 | 判斷方法：將已制備的線性化的載體轉(zhuǎn)化涂板，如果長(zhǎng)克隆較多，則表示線性化 。 解決方案：若線性化 則需優(yōu)化酶切體系，例如提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長(zhǎng)酶切反應(yīng)時(shí)間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等。 |
原因2：反應(yīng)體系中混入了相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒 | 判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉(zhuǎn)化涂板，如果長(zhǎng)克隆較多，則表示有相同抗性的環(huán)狀質(zhì)?；烊?。 解決方案：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用DpnI消化模板后，再進(jìn)行膠回收純化處理或直接進(jìn)行膠回收純化處理，去除殘留的環(huán)狀模板質(zhì)粒導(dǎo)致的假陽(yáng)性。 | |
假陽(yáng)性—含不正確的插入片段？ | 原因1：PCR產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物 | 可能情況：PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)有非特異條帶出現(xiàn)，未進(jìn)行膠回收純化。 解決方案： ①優(yōu)化PCR體系，提高特異性； ②膠回收PCR產(chǎn)物； ③鑒定更多的克隆。 |
原因2：片段缺失 | 可能情況：載體或片段有多個(gè)同源重復(fù)序列。 解決方案：借助網(wǎng)站或軟件進(jìn)行序列比對(duì)（如NCBI，VectorNTI等）。 | |
菌落PCR無(wú)目的條帶？ | 原因1：菌落PCR引物錯(cuò)誤 | 推薦使用載體的通用引物進(jìn)行菌檢，或至少使用一條通用引物。 |
原因2：PCR試劑Mix不穩(wěn)定，PCR體系或程序不合適 | ①更換新的PCR試劑盒 ②優(yōu)化PCR體系、程序； ③提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證； ④換成質(zhì)粒酶切鑒定陽(yáng)性克隆。 | |
原因3：載體線性化 | 可能情況：目的片段引物+一端載體通用引物，或另一端目的片段引物擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物，而載體通用引物擴(kuò)增有產(chǎn)物，且大小符合空載。 解決方案：優(yōu)化酶切體系。例如提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長(zhǎng)酶切反應(yīng)時(shí)間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等。 | |
測(cè)序后插入片段有缺失或者突變？ | 原因1：PCR擴(kuò)增試劑的高保真性不強(qiáng)，導(dǎo)致位點(diǎn)缺失或突變 | 快速克隆試劑盒作用于15-25 bp的同源臂上，不會(huì)導(dǎo)致片段中間的位點(diǎn)缺失或者突變。 解決方案：更換保真性更高的PCR擴(kuò)增試劑盒 |
原因2：在切膠回收過(guò)程中，紫外下切膠過(guò)久導(dǎo)致突變 | 減少切膠時(shí)間，避免膠長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外光下。 |
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