細(xì)胞治療是指獲取人自體或異體來源的具有特定功能的活細(xì)胞，經(jīng)體外操作后輸入人體，達(dá)到治療某種疾病的目的。根據(jù)細(xì)胞類型的不同，可以分為免疫細(xì)胞治療、干細(xì)胞治療及其他細(xì)胞治療。

CAR-T和TCR-T都屬于比較主流的特異性免疫細(xì)胞治療，且細(xì)胞來源相同，均來自外周血單核細(xì)胞（PBMC）、自體或同種異體細(xì)胞。

CAR-T細(xì)胞療法的作用機(jī)制是利用慢病毒（LV）等作為遞送載體，將CAR基因序列轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞基因組，使T細(xì)胞特異性識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞，然后通過釋放穿孔素等因子殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療目的。其具有殺腫瘤效果好、治療效果持久、適用高齡人群也適宜聯(lián)合用藥等優(yōu)勢。

TCR-T細(xì)胞療法的作用機(jī)制是先從患者血液或腫瘤組織中分離出T細(xì)胞，然后從單個T細(xì)胞克隆中分離出TCRα和β鏈，并插入慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，再進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，將目標(biāo)TCRαβ序列引入T細(xì)胞中，獲得能夠特異性識別腫瘤抗原的TCR-T細(xì)胞，這些經(jīng)過修飾的T細(xì)胞隨后在體外擴(kuò)增，以獲得足夠的數(shù)量用于治療和重新輸回患者體內(nèi)。TCR-T療法具有較強(qiáng)的靶向性、滲透性和穩(wěn)定性等優(yōu)勢。

CAR-T和TCR-T均因能夠表達(dá)特異性受體，靶向識別特異性的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞，受到廣泛的關(guān)注和研究。但這兩種療法在抗腫瘤和緩解患者疾病的同時，也會引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴和神經(jīng)毒性等副作用。因此，國家藥監(jiān)局等國內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)對免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品制定了一系列的指導(dǎo)原則和指南等，來規(guī)范和指導(dǎo)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的研發(fā)、申報(bào)和評價。

拷貝數(shù)是指某基因（可以是質(zhì)粒）在某一生物的基因組中的個數(shù)。單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個，多拷貝則指有多個。

已知CAR-T和TCR-T細(xì)胞治療，均是將含有CAR或TCRαβ序列的目的基因構(gòu)建到慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后進(jìn)行病毒感染T細(xì)胞，獲得CAR-T或TCR-T細(xì)胞。這些載體基因整合在T細(xì)胞基因組中，一方面顯示有T細(xì)胞進(jìn)行了CAR或TCR基因修飾，一方面又是一個安全性指標(biāo)，可能會因整合而帶來原癌基因的激活或抑癌基因的失活等造成二次腫瘤的風(fēng)險。盡管現(xiàn)在載體的設(shè)計(jì)已經(jīng)大大降低了整合的風(fēng)險，但這種風(fēng)險仍未消除，因此需要對整合到細(xì)胞基因組中的病毒載體拷貝數(shù)進(jìn)行檢測。

針對CAR和TCR基因整合帶來的潛在風(fēng)險，國內(nèi)外的藥品監(jiān)管相關(guān)機(jī)構(gòu)都發(fā)布了相應(yīng)的指導(dǎo)性文件。

2018年6月，中國食品藥品檢定研究院頒發(fā)的《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》明確規(guī)定CAR基因拷貝數(shù)≤5 copies/細(xì)胞。

美國FDA也于2022年3月15日發(fā)布了《嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞治療的研發(fā)考量》指南草案，提到載體拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因整合可能改變細(xì)胞基因的表達(dá)，并導(dǎo)致致瘤性。因此，制劑中的轉(zhuǎn)基因整合是衡量CAR-T和TCR-T等細(xì)胞放行的重要安全參數(shù)。

目前，實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）廣泛用于基因表達(dá)、拷貝數(shù)確定和病原體檢測研究等，這種方法可以準(zhǔn)確定量樣品中DNA或RNA的核酸靶序列數(shù)量。因此，CAR和TCR等轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測行業(yè)內(nèi)也普遍采用qPCR的方法。

CAR/TCR基因拷貝數(shù)的檢測，主要包括CAR-T或TCR-T細(xì)胞懸液收獲階段和接受CAR-T或TCR-T細(xì)胞治療的患者定期取外周血隨訪監(jiān)測階段。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測試劑盒，采用多重?zé)晒馓结榪PCR法分別檢測CAR-T或TCR-T細(xì)胞基因組中CAR或TCR基因的拷貝數(shù)以及人體細(xì)胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。

下圖就CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測工作流程，進(jìn)行了詳細(xì)介紹：

符合法規(guī)：按照法規(guī)要求進(jìn)行全面驗(yàn)證，可提供驗(yàn)證報(bào)告；

保障品質(zhì)：試劑盒原材料全自主研發(fā)，qPCR Mix等酶產(chǎn)品在超潔凈酶工廠生產(chǎn)；

靈敏度高：定量限可達(dá)101copies/μL水平；

精密度高：批內(nèi)重復(fù)性高，批間差異??；

專屬性強(qiáng)：特異性檢測CAR或TCR基因拷貝數(shù)，不受其他外源基因組DNA干擾；

防干擾強(qiáng)：添加內(nèi)部對照（IC），便于排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等因素

[1] 中國食品藥品檢定研究院，CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)，2018.

[2] FDA.Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products Draft Guidance for Industry,March 2022．Docket Number:FDA-2021-D-0404.Issued by:Center for Biologics Evaluation and Research.

[3] Kunz A, Gern U, Schmitt A, et al. Optimized Assessment of qPCR-Based Vector Copy Numbers as a Safety Parameter for GMP-Grade CAR T Cells and Monitoring of Frequency in Patients. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Feb 20; 17:448-454. doi: 10.1016/j.omtm.2020.02.003. PMID: 32201711; PMCID: PMC7078460.