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CAR/TCR拷貝數(shù)檢測(cè)概念
CAR-T和TCR-T都屬于比較主流的特異性免疫細(xì)胞治療，且細(xì)胞來(lái)源相同，均來(lái)自外周血單核細(xì)胞（PBMC）、自體或同種異體細(xì)胞。
CAR-T細(xì)胞療法的作用機(jī)制是利用慢病毒（LV）等作為遞送載體，將CAR基因序列轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞基因組，使T細(xì)胞特異性識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞，然后通過(guò)釋放穿孔素等因子殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療目的。其具有殺腫瘤效果好、治療效果持久、適用高齡人群也適宜聯(lián)合用藥等優(yōu)勢(shì)。
TCR-T細(xì)胞療法的作用機(jī)制是先從患者血液或腫瘤組織中分離出T細(xì)胞，然后從單個(gè)T細(xì)胞克隆中分離出TCRα和β鏈，并插入慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，再進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，將目標(biāo)TCRαβ序列引入T細(xì)胞中，獲得能夠特異性識(shí)別腫瘤抗原的TCR-T細(xì)胞，這些經(jīng)過(guò)修飾的T細(xì)胞隨后在體外擴(kuò)增，以獲得足夠的數(shù)量用于治療和重新輸回患者體內(nèi)。TCR-T療法具有較強(qiáng)的靶向性、滲透性和穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)。
但這兩種療法都將目的基因構(gòu)建到慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后進(jìn)行病毒感染T細(xì)胞，獲得CAR-T或TCR-T細(xì)胞。這些載體基因整合在T細(xì)胞基因組中，一方面顯示有T細(xì)胞進(jìn)行了CAR或TCR基因修飾，一方面又是一個(gè)安全性指標(biāo)，可能會(huì)因整合而帶來(lái)原癌基因的激活或抑癌基因的失活等造成二次腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。盡管現(xiàn)在載體的設(shè)計(jì)已經(jīng)大大降低了整合的風(fēng)險(xiǎn)，但這種風(fēng)險(xiǎn)仍未消除，因此需要對(duì)整合到細(xì)胞基因組中的病毒載體拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
法規(guī)監(jiān)管要求
針對(duì)CAR和TCR基因整合帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，國(guó)內(nèi)外的藥品監(jiān)管相關(guān)機(jī)構(gòu)都發(fā)布了相應(yīng)的指導(dǎo)性文件。
2018年6月，中國(guó)食品藥品檢定研究院頒發(fā)的《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測(cè)研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》明確規(guī)定CAR基因拷貝數(shù)≤5 copies/細(xì)胞。
國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2021年發(fā)布的《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》指導(dǎo)原則也有提及：對(duì)于經(jīng)過(guò)基因修飾的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品如CAR-T，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)和流式細(xì)胞術(shù)（Flowcytometry）進(jìn)行PK分析，分別通過(guò)測(cè)定外源基因拷貝和CAR+細(xì)胞數(shù)量的變化，有助于互相驗(yàn)證檢測(cè)方法的可靠性，可以更全面的分析產(chǎn)品在體內(nèi)的擴(kuò)增和存活情況。
FDA相關(guān)的指導(dǎo)原則是2022年發(fā)布的《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products, Draft Guidance for Industry》指南草案，提到：在臨床階段，推薦采用根據(jù)體重或體表面積計(jì)算的CAR-T細(xì)胞數(shù)來(lái)確定劑量水平，在對(duì)PK的研究中，CAR-T細(xì)胞在人體樣本（如血液和骨髓）中的擴(kuò)增和持續(xù)，可通過(guò)收集特定時(shí)間點(diǎn)的樣本來(lái)測(cè)定。推薦含足夠采樣時(shí)間點(diǎn)，尤其是在擴(kuò)增期，即約為給藥后兩周左右，方法可采用檢測(cè)CAR基因拷貝數(shù)和CAR的表達(dá)。
檢測(cè)方法的選擇
在CAR-T細(xì)胞的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)評(píng)估中，CAR陽(yáng)性率作為CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品活性的關(guān)鍵特征，其數(shù)量和比例尤為重要。目前，CAR陽(yáng)性率的檢測(cè)方法主要有：流式細(xì)胞術(shù)、抗藥抗體(ADA)檢測(cè)、分子生物學(xué)水平檢測(cè)等方法。
不同于流式細(xì)胞術(shù)、抗藥抗體檢測(cè)等方法是靶向CAR-T細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測(cè)，分子生物學(xué)檢測(cè)CAR陽(yáng)性率的過(guò)程是基于CAR結(jié)構(gòu)酶切位點(diǎn)的前后兩端序列和CAR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域等序列來(lái)源作為引物的設(shè)計(jì)模板，在分子水平上測(cè)定CAR分子的基因序列，從而鑒定和確認(rèn)目標(biāo)CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染基因拷貝數(shù)。該方法的優(yōu)勢(shì)在于可以輕松提供有關(guān)擴(kuò)增和動(dòng)力學(xué)的量化基因組水平信息，甚至可以檢測(cè)外周血中極少量的CAR-T細(xì)胞。
目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）廣泛用于CAR和TCR等轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)中。
CAR/TCR基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，主要包括CAR-T或TCR-T細(xì)胞懸液收獲階段和接受CAR-T或TCR-T細(xì)胞治療的患者定期取外周血隨訪監(jiān)測(cè)階段。
針對(duì)上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，采用多重?zé)晒馓结榪PCR法分別檢測(cè)CAR-T或TCR-T細(xì)胞基因組中CAR或TCR基因的拷貝數(shù)以及人體細(xì)胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器。
下圖就CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測(cè)工作流程，進(jìn)行了詳細(xì)介紹：
CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測(cè)Kit產(chǎn)品性能
符合法規(guī)：按照法規(guī)要求進(jìn)行全面驗(yàn)證，可提供驗(yàn)證報(bào)告；
保障品質(zhì)：試劑盒原材料全自主研發(fā)，qPCR Mix等酶產(chǎn)品在超潔凈酶工廠生產(chǎn)；
靈敏度高：檢測(cè)限可達(dá)1.05copies/μL；
精密度高：批內(nèi)重復(fù)性高，批間差異?。?/span>
專屬性強(qiáng)：特異性檢測(cè)CAR或TCR基因拷貝數(shù)，不受其他外源基因組DNA干擾；
防干擾強(qiáng)：添加內(nèi)部對(duì)照（IC），便于排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等因素。
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品 | 貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18462ES | MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預(yù)封裝） | 2×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80501ES | Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system Auto-Pure 32A全自動(dòng)核酸提取儀 | 32通量 |
qPCR檢測(cè) 試劑盒 | 41313ES | CAR/TCR Copynumber Detection Kit CAR/TCR 基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒 | 50T/100T |
參考文獻(xiàn)：
[1]中國(guó)食品藥品檢定研究院. CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測(cè)研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)[J].中國(guó)藥事，2018,32(6):829-852.
[2]免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心, 2021.
[3]FDA.Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products Draft Guidance for Industry,March 2022．Docket Number:FDA-2021-D-0404.Issued by:Center for Biologics Evaluation and Research.
[4]Kunz A, Gern U, Schmitt A, et al. Optimized Assessment of qPCR-Based Vector Copy Numbers as a Safety Parameter for GMP-Grade CAR T Cells and Monitoring of Frequency in Patients. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Feb 20; 17:448-454. doi: 10.1016/j.omtm.2020.02.003. PMID: 32201711; PMCID: PMC7078460.
