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CAR/TCR拷貝數(shù)檢測概念
CAR-T和TCR-T都屬于比較主流的特異性免疫細胞治療，且細胞來源相同，均來自外周血單核細胞（PBMC）、自體或同種異體細胞。
CAR-T細胞療法的作用機制是利用慢病毒（LV）等作為遞送載體，將CAR基因序列轉(zhuǎn)移到T細胞基因組，使T細胞特異性識別并結(jié)合腫瘤細胞，然后通過釋放穿孔素等因子殺傷腫瘤細胞，從而達到治療目的。其具有殺腫瘤效果好、治療效果持久、適用高齡人群也適宜聯(lián)合用藥等優(yōu)勢。
TCR-T細胞療法的作用機制是先從患者血液或腫瘤組織中分離出T細胞，然后從單個T細胞克隆中分離出TCRα和β鏈，并插入慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，再進行病毒轉(zhuǎn)染T細胞，將目標TCRαβ序列引入T細胞中，獲得能夠特異性識別腫瘤抗原的TCR-T細胞，這些經(jīng)過修飾的T細胞隨后在體外擴增，以獲得足夠的數(shù)量用于治療和重新輸回患者體內(nèi)。TCR-T療法具有較強的靶向性、滲透性和穩(wěn)定性等優(yōu)勢。
但這兩種療法都將目的基因構(gòu)建到慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后進行病毒感染T細胞，獲得CAR-T或TCR-T細胞。這些載體基因整合在T細胞基因組中，一方面顯示有T細胞進行了CAR或TCR基因修飾，一方面又是一個安全性指標，可能會因整合而帶來原癌基因的激活或抑癌基因的失活等造成二次腫瘤的風(fēng)險。盡管現(xiàn)在載體的設(shè)計已經(jīng)大大降低了整合的風(fēng)險，但這種風(fēng)險仍未消除，因此需要對整合到細胞基因組中的病毒載體拷貝數(shù)進行檢測。
法規(guī)監(jiān)管要求
針對CAR和TCR基因整合帶來的潛在風(fēng)險，國內(nèi)外的藥品監(jiān)管相關(guān)機構(gòu)都發(fā)布了相應(yīng)的指導(dǎo)性文件。
2018年6月，中國食品藥品檢定研究院頒發(fā)的《CAR-T細胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》明確規(guī)定CAR基因拷貝數(shù)≤5 copies/細胞。
國家藥品監(jiān)督管理局于2021年發(fā)布的《免疫細胞治療產(chǎn)品臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》指導(dǎo)原則也有提及：對于經(jīng)過基因修飾的免疫細胞治療產(chǎn)品如CAR-T，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR)和流式細胞術(shù)（Flowcytometry）進行PK分析，分別通過測定外源基因拷貝和CAR+細胞數(shù)量的變化，有助于互相驗證檢測方法的可靠性，可以更全面的分析產(chǎn)品在體內(nèi)的擴增和存活情況。
FDA相關(guān)的指導(dǎo)原則是2022年發(fā)布的《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products, Draft Guidance for Industry》指南草案，提到：在臨床階段，推薦采用根據(jù)體重或體表面積計算的CAR-T細胞數(shù)來確定劑量水平，在對PK的研究中，CAR-T細胞在人體樣本（如血液和骨髓）中的擴增和持續(xù)，可通過收集特定時間點的樣本來測定。推薦含足夠采樣時間點，尤其是在擴增期，即約為給藥后兩周左右，方法可采用檢測CAR基因拷貝數(shù)和CAR的表達。
檢測方法的選擇
在CAR-T細胞的藥代動力學(xué)(PK)評估中，CAR陽性率作為CAR-T細胞產(chǎn)品活性的關(guān)鍵特征，其數(shù)量和比例尤為重要。目前，CAR陽性率的檢測方法主要有：流式細胞術(shù)、抗藥抗體(ADA)檢測、分子生物學(xué)水平檢測等方法。
不同于流式細胞術(shù)、抗藥抗體檢測等方法是靶向CAR-T細胞的比例進行檢測，分子生物學(xué)檢測CAR陽性率的過程是基于CAR結(jié)構(gòu)酶切位點的前后兩端序列和CAR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域等序列來源作為引物的設(shè)計模板，在分子水平上測定CAR分子的基因序列，從而鑒定和確認目標CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染基因拷貝數(shù)。該方法的優(yōu)勢在于可以輕松提供有關(guān)擴增和動力學(xué)的量化基因組水平信息，甚至可以檢測外周血中極少量的CAR-T細胞。
目前，實時熒光定量PCR（qPCR）廣泛用于CAR和TCR等轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測中。
CAR/TCR基因拷貝數(shù)的檢測，主要包括CAR-T或TCR-T細胞懸液收獲階段和接受CAR-T或TCR-T細胞治療的患者定期取外周血隨訪監(jiān)測階段。
針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測試劑盒，采用多重?zé)晒馓结榪PCR法分別檢測CAR-T或TCR-T細胞基因組中CAR或TCR基因的拷貝數(shù)以及人體細胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。
下圖就CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測工作流程，進行了詳細介紹：
CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測Kit產(chǎn)品性能
符合法規(guī)：按照法規(guī)要求進行全面驗證，可提供驗證報告；
保障品質(zhì)：試劑盒原材料全自主研發(fā)，qPCR Mix等酶產(chǎn)品在超潔凈酶工廠生產(chǎn)；
靈敏度高：檢測限可達1.05copies/μL；
精密度高：批內(nèi)重復(fù)性高，批間差異??；
專屬性強：特異性檢測CAR或TCR基因拷貝數(shù)，不受其他外源基因組DNA干擾；
防干擾強：添加內(nèi)部對照（IC），便于排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等因素。
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品 | 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18462ES | MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預(yù)封裝） | 2×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80501ES | Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system Auto-Pure 32A全自動核酸提取儀 | 32通量 |
qPCR檢測 試劑盒 | 41313ES | CAR/TCR Copynumber Detection Kit CAR/TCR 基因拷貝數(shù)檢測試劑盒 | 50T/100T |
參考文獻：
[1]中國食品藥品檢定研究院. CAR-T細胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點[J].中國藥事，2018,32(6):829-852.
[2]免疫細胞治療產(chǎn)品臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）. 國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心, 2021.
[3]FDA.Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products Draft Guidance for Industry,March 2022．Docket Number:FDA-2021-D-0404.Issued by:Center for Biologics Evaluation and Research.
[4]Kunz A, Gern U, Schmitt A, et al. Optimized Assessment of qPCR-Based Vector Copy Numbers as a Safety Parameter for GMP-Grade CAR T Cells and Monitoring of Frequency in Patients. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Feb 20; 17:448-454. doi: 10.1016/j.omtm.2020.02.003. PMID: 32201711; PMCID: PMC7078460.
