RNA研究的進(jìn)展，離不開工具酶的發(fā)現(xiàn)和改造。今天，我們要向大家介紹一種在RNA研究中至關(guān)重要的工具酶——T4 RNA Ligase 1。

T4 RNA Ligase 1是一種ATP依賴性的酶，能催化單鏈RNA、單鏈DNA或單核苷酸之間形成磷酸二酯鍵的連接反應(yīng)。它對(duì)于RNA分子間的連接尤為高效，其次便是DNA與RNA之間的連接，而在連接DNA分子時(shí)效率相對(duì)較低。因此，T4 RNA Ligase 1也被稱為“單鏈RNA連接酶"。在應(yīng)用方面，T4 RNA Ligase 1廣泛應(yīng)用于多個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域，包括microRNA (miRNA)檢測(cè)、RNA文庫(kù)構(gòu)建、環(huán)狀重測(cè)序（CirSeq）、向?qū)NA（gRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）合成等實(shí)驗(yàn)中。

圖1. T4 RNA Ligase 1連接類型示意圖

miRNA檢測(cè)在深入理解基因調(diào)控機(jī)制、發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)標(biāo)志物、指導(dǎo)早期診斷、預(yù)后評(píng)估和制定治療策略等方面具有關(guān)鍵作用。然而，由于miRNA的長(zhǎng)度一般只有20-30 nt，與標(biāo)準(zhǔn)PCR引物長(zhǎng)度相近，這給檢測(cè)帶來(lái)了一定的困難。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家們巧妙地利用T4 RNA Ligase 1將miRNA首尾相連成為circRNA，并結(jié)合RT-qPCR技術(shù)，研發(fā)出了一種名為miR-ID的新型檢測(cè)方法。miR-ID技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)RT-qPCR方法在miRNA檢測(cè)時(shí)復(fù)雜的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)問(wèn)題，同時(shí)，其滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程能夠生成含有大量重復(fù)目標(biāo)序列的cDNA，這使得miRNA和其他小RNA分子的檢測(cè)變得極為靈敏。這一創(chuàng)新為miRNA檢測(cè)提供了一種更為可靠和有效的工具，進(jìn)一步推動(dòng)了miRNA研究和臨床應(yīng)用的發(fā)展。

miR-ID包括以下步驟：

圖2. T4 RNA Ligase 1應(yīng)用于miR-ID流程圖[1]

構(gòu)建RNA測(cè)序文庫(kù)是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及RNA的富集、片段化、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、接頭連接以及PCR擴(kuò)增等關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)方法中，這流-程不僅繁瑣，還要求進(jìn)行三次樣品純化，增加了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和成本。此外，使用隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成可能會(huì)引入偏差，導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄效率不均一，從而影響測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

T4 RNA Ligase 1的引入為簡(jiǎn)化建庫(kù)流程帶來(lái)了突破。它允許直接在斷裂的RNA分子上連接接頭，繞過(guò)了隨機(jī)引物的使用，從而避免了由反轉(zhuǎn)錄不平衡引起的擴(kuò)增偏差。通過(guò)采用T4 RNA Ligase 1，測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的質(zhì)量得以提升，而且純化步驟從三步縮減至兩步，顯著節(jié)約了純化試劑和時(shí)間，并減少了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性與勞動(dòng)成本，使得整個(gè)建庫(kù)流程更為高效和經(jīng)濟(jì)。

圖3. T4 RNA Ligase 1應(yīng)用于RNA建庫(kù)流程圖[2]

在解讀NGS數(shù)據(jù)時(shí)，如何準(zhǔn)確區(qū)分真正的基因變異和測(cè)序錯(cuò)誤是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。這些錯(cuò)誤可能源自兩個(gè)主要方面：NGS測(cè)序過(guò)程中的誤差以及文庫(kù)制備階段的錯(cuò)誤。CirSeq是一種高效且高精度的RNA病毒群體二代測(cè)序技術(shù)。它利用T4 RNA Ligase 1將病毒RNA片段環(huán)化并轉(zhuǎn)化為串聯(lián)重復(fù)的cDNA序列。在測(cè)序過(guò)程中，對(duì)每個(gè)讀段中的冗余拷貝進(jìn)行比對(duì)，從而得到與初始RNA模板一致的序列。這種方法產(chǎn)生的測(cè)序數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率遠(yuǎn)低于RNA病毒變異頻率，有助于超罕見(jiàn)變異的檢出和低頻變異的準(zhǔn)確測(cè)量。

圖4. T4 RNA Ligase 1應(yīng)用于CirSeq流程圖[3]

CRISPR/Cas系統(tǒng)，一種廣泛使用的基因組編輯技術(shù)，它由Cas蛋白和人工重組的gRNA組成。這種系統(tǒng)能夠精確指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行敲除、插入和突變修飾。目前，我們主要采用體外轉(zhuǎn)錄和化學(xué)合成的方法來(lái)制備gRNA?；瘜W(xué)合成法憑借其編輯效率高、細(xì)胞毒性低以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中得到了廣泛的認(rèn)可。然而，這種方法也存在一些局限性，如合成長(zhǎng)度的限制以及副產(chǎn)物難以 去除等問(wèn)題。為了克服這些困難，研究者們已經(jīng)嘗試使用RNA連接酶將多個(gè)合成的RNA連接在一起，通過(guò)這種方式，提高gRNA的純度、產(chǎn)量和完整性，從而有效提高編輯效率并減少非特異性編輯的發(fā)生。

圖5. T4 RNA Ligase 1應(yīng)用于gRNA合成示例

線性RNA在生物學(xué)研究和治療中具有廣泛的應(yīng)用，然而其較短的半衰期限制了其在長(zhǎng)期蛋白質(zhì)翻譯方面的應(yīng)用。與此不同，circRNA是一種閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA，廣泛存在于各種生物體中，具有更高的穩(wěn)定性和非帽依賴蛋白質(zhì)翻譯的特點(diǎn)。因此，circRNA疫苗被認(rèn)為是新一代RNA疫苗及藥物的潛在選擇，具備更簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性更好和持久性更長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。目前，合成circRNA的方法主要包括酶促連接合成和化學(xué)合成兩種。其中，酶促連接合成通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，利用DNA模板、T7 RNA聚合酶和RNA連接酶(如T4 RNA Ligase 1)等進(jìn)行。酶促連接合成能夠以較低成本實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)的circRNA合成，因此在目前被廣泛應(yīng)用。

圖6. T4 RNA Ligase 1環(huán)化機(jī)理

T4 RNA Ligase 1作為一種多功能酶，在RNA研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其應(yīng)用不僅限于上述領(lǐng)域。翌圣生物專注于RNA研究領(lǐng)域，提供與RNA研究相關(guān)的工具酶原料，為RNA研究技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展提供支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kumar P, Johnston B H, Kazakov S A. miR-ID: a novel, circularization-based platform for detection of microRNAs[J]. Rna, 2011, 17(2): 365-380.

[2] Fuchs R T, Sun Z, Zhuang F, et al. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure[J]. PloS one, 2015, 10(5): e0126049.

[3] Acevedo A, Andino R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nat Protoc. 2014;9(7):1760-1769. doi:10.1038/nprot.2014.118.