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近些年，隨著生物醫(yī)藥迅猛發(fā)展、疫情下細(xì)胞基因治療以及mRNA疫苗的相繼涌現(xiàn)，如何把控生物制品安全可靠，成為各國(guó)法規(guī)政府重視以及監(jiān)管的要點(diǎn)。支原體是一種比較常見(jiàn)但通常難以去除的污染類型，對(duì)于涉及細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品工藝過(guò)程，法規(guī)要求“必須確保無(wú)支原體污染"。
監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求的支原體檢測(cè)點(diǎn)
2020版中國(guó)藥典三部《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制》中提出對(duì)于生產(chǎn)用細(xì)胞，需要對(duì)主細(xì)胞庫(kù)（MCB）、工作細(xì)胞庫(kù)（WCB）、生產(chǎn)終末細(xì)胞（EOPC）進(jìn)行支原體檢查；
《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中建議在關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)對(duì)適合的中間樣品開(kāi)展支原體等安全性相關(guān)檢測(cè)或采取相關(guān)的措施加以控制，并且支原體同樣需要作為終產(chǎn)品的放行檢項(xiàng)；
FDA , Guidance for Industry : Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，中提出對(duì)于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進(jìn)行支原體控制。
NAT法和傳統(tǒng)方法
在快速檢測(cè)方法（NAT，核酸擴(kuò)增技術(shù)）出現(xiàn)之前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法因其檢測(cè)周期長(zhǎng)或靈敏度問(wèn)題，致使企業(yè)生產(chǎn)或產(chǎn)品放行周期拉長(zhǎng)或者需要基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)細(xì)胞原料進(jìn)行條件放行或者尋求其他替代方法。而隨著細(xì)胞基因治療的發(fā)展，行業(yè)內(nèi)對(duì)支原體檢測(cè)時(shí)效性和靈敏度要求越來(lái)越高，短的貨架期不足以支撐如此長(zhǎng)的檢測(cè)周期，因此NAT方法從眾多支原體檢測(cè)方法中脫穎而出。
目前歐洲藥典（EP）<2.6.7>，日本藥典（JP）以及美國(guó)藥典（USP）<63>都已收錄NAT方法作為支原體檢測(cè)方法，但需要對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證以及與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比其檢測(cè)靈敏度不低于傳統(tǒng)方法，才可以使用。2020版中國(guó)藥典（ChP）雖然并未收錄NAT法作為支原體檢測(cè)方法，但其中也提到了“也可采用經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法"。2022年5月，國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中提到“當(dāng)檢驗(yàn)樣品量有限，或需要快速放行等特殊情況下，如藥典方法無(wú)法滿足，可考慮開(kāi)發(fā)新型的無(wú)菌和支原體的檢測(cè)方法進(jìn)行放行檢測(cè)，但是新型檢測(cè)方法應(yīng)經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證"。所以NAT法有望作為能夠支持快速支原體放行檢測(cè)的方法，被越來(lái)越多的原材料供應(yīng)商、以及ATMP企業(yè)所使用。
中外法規(guī)里列舉的支原體檢測(cè)方法
翌圣生物MycAway®支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（探針?lè)ǎ?2G)是基于NAT (nucleic acid amplification techniques)的一種快速定性檢測(cè)生產(chǎn)原料、細(xì)胞庫(kù)、病毒種子、病毒或細(xì)胞收獲液、治療用細(xì)胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品。
該試劑盒基于定量PCR技術(shù)，采用多重PCR的方法，使用2種熒光探針，F(xiàn)AM和CY5，分別檢測(cè)目標(biāo)序列和內(nèi)參。相較40618ES貨號(hào)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒，該2G版本可覆蓋多達(dá)183種支原體DNA序列，所需待測(cè)樣本的模板量也減少了一半，還可兼容更多品牌的qPCR儀器。
同時(shí)，MycAway®支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（探針?lè)ǎ?2G)也嚴(yán)格按照EP 2.6.7進(jìn)行專屬性、檢測(cè)限、耐用性的全面驗(yàn)證，檢測(cè)限滿足≤10 CFU/mL的要求。同時(shí)覆蓋USP、JP、WHO、ChP等中要求驗(yàn)證的支原體菌株類型，試劑盒性能符合中外法規(guī)要求，助力生物醫(yī)藥客戶的藥物研發(fā)項(xiàng)目臨床實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)等的順利受理。
產(chǎn)品資質(zhì)
符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗(yàn)證，符合國(guó)際機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)；
配合審計(jì)：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)，有完善的審計(jì)文件；
保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn)，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定；
技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀，Kit靈敏度可達(dá)10CFU/mL及以下；
專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫(kù)，雙封閉抗體提高了Kit特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。
產(chǎn)品特點(diǎn)
檢測(cè)種類多：優(yōu)化的TaqMan探針可檢測(cè)多達(dá)183種支原體；
操作簡(jiǎn)便：樣本制備和檢測(cè)總時(shí)長(zhǎng)<3h，無(wú)需培養(yǎng)法的28天等待；
靈敏度高：檢測(cè)限達(dá)到可以替代直接培養(yǎng)法的10CFU/mL；
專屬性強(qiáng)：針對(duì)16s rRNA設(shè)計(jì)引物探針，不與梭菌、乳桿菌等親緣關(guān)系物種交叉反應(yīng)；
安全性高：試劑盒內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照(PC)無(wú)感染性，全消除污染風(fēng)險(xiǎn)；
防干擾強(qiáng)：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC)，可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等因素，有效避免假陰性。
完整解決方案
翌圣生物NAT法支原體qPCR檢測(cè)
翌圣生物MycAway™支原體qPCR檢測(cè)試劑盒(探針?lè)?能夠與MolPure®磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，可以通過(guò)手動(dòng)提取或者使用自動(dòng)化核酸提取儀自動(dòng)提取樣本核酸。樣本經(jīng)過(guò)前處理去除干擾雜質(zhì)獲得純化的支原體DNA后，通過(guò)qPCR收集探針的熒光信號(hào)，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。
驗(yàn)證內(nèi)容
性能 | 驗(yàn)證參數(shù) | 試劑盒驗(yàn)證結(jié)果 |
檢測(cè)限 | 支原體菌株檢測(cè)限 | 10種法規(guī)藥典要求的支原體10CFU/mL，分別檢測(cè)24次，檢出率≥95% |
專屬性 | 樣本基質(zhì)干擾 | 檢測(cè)了9種樣本基質(zhì)和DNA稀釋液，均未檢出支原體 |
交叉反應(yīng) | 檢測(cè)了14種菌株、6種生物醫(yī)藥常用工程細(xì)胞，均未檢出支原體 | |
耐用性 | 凍融穩(wěn)定性 | 可經(jīng)受反復(fù)20次凍融，試劑盒性能不受影響 |
熱加速穩(wěn)定性 | 37℃條件下14天和4℃條件下30天，試劑盒性能不受影響 | |
儀器適用性 | 適用ABI7500、ABI QuantStudio™5、Bio-Rad CFX96、羅氏LightCycler®480 | |
覆蓋度 | 覆蓋支原體DNA種類 | 通過(guò)支原體16SrRNA序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，覆蓋183種柔膜菌綱物種 |
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品 | 貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18467ES | MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預(yù)封裝) | 3×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80511ES | 48通道自動(dòng)化核酸提取儀 | 48通量 |
支原體檢測(cè) 試劑盒 | 40619ES | MycAway® Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G) 支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（探針?lè)ǎ?/span>(2G)
| 25T/100T |
