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近些年，隨著生物醫(yī)藥迅猛發(fā)展、疫情下細胞基因治療以及mRNA疫苗的相繼涌現(xiàn)，如何把控生物制品安全可靠，成為各國法規(guī)政府重視以及監(jiān)管的要點。支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染"。
監(jiān)管機構(gòu)要求的支原體檢測點
2020版中國藥典三部《生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制》中提出對于生產(chǎn)用細胞，需要對主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）、生產(chǎn)終末細胞（EOPC）進行支原體檢查；
《免疫細胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中建議在關(guān)鍵時間點對適合的中間樣品開展支原體等安全性相關(guān)檢測或采取相關(guān)的措施加以控制，并且支原體同樣需要作為終產(chǎn)品的放行檢項；
FDA , Guidance for Industry : Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，中提出對于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進行支原體控制。
NAT法和傳統(tǒng)方法
在快速檢測方法（NAT，核酸擴增技術(shù)）出現(xiàn)之前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和指示細胞法因其檢測周期長或靈敏度問題，致使企業(yè)生產(chǎn)或產(chǎn)品放行周期拉長或者需要基于風險評估對細胞原料進行條件放行或者尋求其他替代方法。而隨著細胞基因治療的發(fā)展，行業(yè)內(nèi)對支原體檢測時效性和靈敏度要求越來越高，短的貨架期不足以支撐如此長的檢測周期，因此NAT方法從眾多支原體檢測方法中脫穎而出。
目前歐洲藥典（EP）<2.6.7>，日本藥典（JP）以及美國藥典（USP）<63>都已收錄NAT方法作為支原體檢測方法，但需要對該方法進行驗證以及與傳統(tǒng)方法進行對比其檢測靈敏度不低于傳統(tǒng)方法，才可以使用。2020版中國藥典（ChP）雖然并未收錄NAT法作為支原體檢測方法，但其中也提到了“也可采用經(jīng)國家藥品檢定機構(gòu)認可的其他方法"。2022年5月，國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《免疫細胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中提到“當檢驗樣品量有限，或需要快速放行等特殊情況下，如藥典方法無法滿足，可考慮開發(fā)新型的無菌和支原體的檢測方法進行放行檢測，但是新型檢測方法應(yīng)經(jīng)過充分驗證"。所以NAT法有望作為能夠支持快速支原體放行檢測的方法，被越來越多的原材料供應(yīng)商、以及ATMP企業(yè)所使用。
中外法規(guī)里列舉的支原體檢測方法
翌圣生物MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)是基于NAT (nucleic acid amplification techniques)的一種快速定性檢測生產(chǎn)原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品。
該試劑盒基于定量PCR技術(shù)，采用多重PCR的方法，使用2種熒光探針，F(xiàn)AM和CY5，分別檢測目標序列和內(nèi)參。相較40618ES貨號的支原體qPCR檢測試劑盒，該2G版本可覆蓋多達183種支原體DNA序列，所需待測樣本的模板量也減少了一半，還可兼容更多品牌的qPCR儀器。
同時，MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)也嚴格按照EP 2.6.7進行專屬性、檢測限、耐用性的全面驗證，檢測限滿足≤10 CFU/mL的要求。同時覆蓋USP、JP、WHO、ChP等中要求驗證的支原體菌株類型，試劑盒性能符合中外法規(guī)要求，助力生物醫(yī)藥客戶的藥物研發(fā)項目臨床實驗申請等的順利受理。
產(chǎn)品資質(zhì)
符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗證，符合國際機構(gòu)的標準；
配合審計：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標準，有完善的審計文件；
保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn)，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定；
技術(shù)經(jīng)驗積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀，Kit靈敏度可達10CFU/mL及以下；
專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。
產(chǎn)品特點
檢測種類多：優(yōu)化的TaqMan探針可檢測多達183種支原體；
操作簡便：樣本制備和檢測總時長<3h，無需培養(yǎng)法的28天等待；
靈敏度高：檢測限達到可以替代直接培養(yǎng)法的10CFU/mL；
專屬性強：針對16s rRNA設(shè)計引物探針，不與梭菌、乳桿菌等親緣關(guān)系物種交叉反應(yīng)；
安全性高：試劑盒內(nèi)陽性對照(PC)無感染性，全消除污染風險；
防干擾強：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC)，可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等因素，有效避免假陰性。
完整解決方案
翌圣生物NAT法支原體qPCR檢測
翌圣生物MycAway™支原體qPCR檢測試劑盒(探針法)能夠與MolPure®磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，可以通過手動提取或者使用自動化核酸提取儀自動提取樣本核酸。樣本經(jīng)過前處理去除干擾雜質(zhì)獲得純化的支原體DNA后，通過qPCR收集探針的熒光信號，從而對檢測結(jié)果進行判定。
驗證內(nèi)容
性能 | 驗證參數(shù) | 試劑盒驗證結(jié)果 |
檢測限 | 支原體菌株檢測限 | 10種法規(guī)藥典要求的支原體10CFU/mL，分別檢測24次，檢出率≥95% |
專屬性 | 樣本基質(zhì)干擾 | 檢測了9種樣本基質(zhì)和DNA稀釋液，均未檢出支原體 |
交叉反應(yīng) | 檢測了14種菌株、6種生物醫(yī)藥常用工程細胞，均未檢出支原體 | |
耐用性 | 凍融穩(wěn)定性 | 可經(jīng)受反復(fù)20次凍融，試劑盒性能不受影響 |
熱加速穩(wěn)定性 | 37℃條件下14天和4℃條件下30天，試劑盒性能不受影響 | |
儀器適用性 | 適用ABI7500、ABI QuantStudio™5、Bio-Rad CFX96、羅氏LightCycler®480 | |
覆蓋度 | 覆蓋支原體DNA種類 | 通過支原體16SrRNA序列進行數(shù)據(jù)庫比對，覆蓋183種柔膜菌綱物種 |
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品 | 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18467ES | MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預(yù)封裝) | 3×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80511ES | 48通道自動化核酸提取儀 | 48通量 |
支原體檢測 試劑盒 | 40619ES | MycAway® Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G) 支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)
| 25T/100T |
