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構建基因文庫是整個高通量測序（NGS）過程中尤為關鍵的一步，基因文庫的質量將直接影響后續(xù)測序工作。接頭（Adapter）是NGS文庫構建環(huán)節(jié)的關鍵部分，其中包含的 Index 序列用于區(qū)分不同樣本，使得單次測序或單個 Flow Cell 通道中允許多個樣本混合測序。隨著測序通量和測序需求的增加，接頭種類上從單端Index、雙端組合型index接頭到UDI接頭，甚至達到上千種index 種類，包裝形式上也從傳統(tǒng)的管式接頭到適配自動化建庫的板式包裝接頭延伸。與此同時，兼容市面上主流的Illumina&MGI平臺的通用接頭也層出不窮，解決不同應用場景下的NGS接頭需求。
接頭的常見類型
根據(jù)樣本身份Index位置可以將接頭分為單端Index接頭和雙端Index接頭
單端Index接頭：指的是僅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端）；
雙端Index接頭：指的在P5和P7端均存在Index。比單端Index能容納更多數(shù)目的樣本，被廣泛使用。
根據(jù)接頭是否匹配PCR-free建庫可以將接頭分為長接頭和短接頭
長接頭又稱為完整接頭：以Illumina平臺接頭為例，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接頭通過TA克隆的方式連接到DNA片段之后，可以直接上機測序（但是當DNA量不夠時還需進行PCR擴增使得產(chǎn)物達到一定的量方可上機測序）；
短接頭又叫不完整接頭：通過TA克隆方式連接到DNA片段上后，必須與短接頭互補的引物進行PCR擴增，有完整的文庫結構后才能上機測序。
Index作為接頭中的重要組成部分，簡單來說Index是混合樣本中不同樣本的“身份"，其本身就是一段堿基序列，一般長6nt或8nt。通過對這種“身份"的識別，就可以在混合樣本中對單個樣本的數(shù)據(jù)進行識別。Index的選擇通常需滿足兩個原則：堿基平衡和熒光信號平衡。
堿基平衡，指的是Index的復雜度和平衡度，是多個Index之間的平衡。組合的原則是：同一組index中的A/T/C/G四種堿基都需要包含，且這4種堿基的比例接近，各占25%左右。
熒光信號平衡，是指在不能保證堿基平衡的情況下，選擇保證熒光信號的平衡。在Illumina平臺中的4通道測序儀中，dG/dT使用綠色熒光標記，dC/dA使用紅色熒光標記。測序時每個循環(huán)里綠色和紅色兩種熒光信號都必須存在以保證測序順利進行。因此在選擇Index時需要考慮綠色信號和紅色信號的平衡。
雙端index之CDI接頭：Combined Dual Index，一對多的接頭，即可以根據(jù)一定的要求對兩端的index進行組合，最終形成的是雙端index文庫
雙端index之UDI&UDB接頭：減少index hopping和mis-assignment
兩端index成組設計，雙端，兩端可交叉驗證。采用雙端index分析數(shù)據(jù)時，可以將index錯誤分配率降低到0.01%，與之前常規(guī)的index排列組合方法對比，index hopping降低了兩個數(shù)量級。使用UDI接頭可以大幅度降低illumina測序過程中因為機器測序或者實驗過程中引入的交叉污染，從而盡可能避免測序數(shù)據(jù)“張冠李戴"的現(xiàn)象。但其實并非UDI接頭可以防止交叉，而是發(fā)生序列交叉了之后，可以丟棄這部分數(shù)據(jù)。
圖4.UDI接頭index排列組合效果圖
UMI接頭：低頻突變檢測、絕對定量的利器
UMI接頭包含P5 Index、P7 Index和UMI元件，其中，UMI分子標簽可以設計為隨機的核苷酸鏈、部分簡并核苷酸鏈或者固定核苷酸鏈。根據(jù)UMI標簽所在的位置，又可以將UMI接頭分為單端UMI（10 nt）接頭（UMI標簽緊隨P7端Index）和雙端UMI（5-8 nt）接頭（UMI標簽位于插入片段兩端）。
在UDI接頭結構的基礎上引入UMI標簽，通過對原始DNA分子片段進行標記，能夠驗證測序結果在原始DNA序列上的一致性，分辨出檢測到的突變是真實的低頻突變還是來源于測序錯誤和PCR擴增錯誤，從而過濾掉背景噪音，實現(xiàn)低頻突變的準確檢測。
圖5.UMI接頭相關結構和產(chǎn)品信息
板式包裝接頭
采用自動化設備來進行高通量NGS樣本建庫，傳統(tǒng)的管式包裝接頭已經(jīng)無法滿足需求。為了更好的匹配當前的自動化設備，針對Illumina和MGI平臺分別開發(fā)了由96微孔板包裝的384 UDI接頭試劑盒。其中，Illumina平臺為完整型長接頭，MGI平臺為截短型接頭。板式包裝接頭搭配自動化建庫試劑盒，可以解決當前的手動建庫試劑盒與自動化平臺的兼容性問題！
圖6.板式包裝接頭試劑盒和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
接頭產(chǎn)品選擇指南
產(chǎn)品類別 | 接頭類型 | 產(chǎn)品名稱 | Index 種類 | 貨號 | |
Illumina平臺 | 管式包裝 | 單端index完整長接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set1/Set2 | 96種 | 13519-13520ES |
雙端Index CDI接頭-DNA | Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina®,Set1/Set2 | 384種 | 12412-12413ES | ||
雙端Index CDI接頭-RNA | Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer for Illumina®,Set1/Set2 | 384種 | 12414-12415ES | ||
雙端Index UMI接頭 | Hieff NGS® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina®，Set1/Set2 | 96種 | 13370-13371ES | ||
轉座酶接頭引物 | Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® | 384種 | 12416ES | ||
板式包裝 | 單端index完整長接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina（板式） | 96種 | 13585ES | |
雙端Index UDI長接頭 | Hieff NGS® Full UDI Adapter Kit for Illumina® Set1-Set4（板式） | 384種 | 12333-12336ES | ||
雙端Index UDI接頭 | Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina® Set1/Set2/Set3/Set4（/Set5-Set8/Set9-Set12板式） | 1152種 | 12327-12332ES | ||
管式包裝 | 通用PE adapter | Hieff NGS® C177P1 PE Adapter for Illumina® | - | 12939ES | |
MGI平臺 | 管式包裝 | 單端index完整長接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI,Set1/Set2/Set3 | 96種 | 13361-13362ES |
雙端Index UMI接頭 | Hieff NGS® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI®,Set1/Set2 | 96種 | 13367-13368ES | ||
板式包裝 | 單端index完整長接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI® | 96種 | 13585ES | |
雙端Index UDB接頭 | Hieff NGS® Unique Dual Barcode Adapter Kit for MGI®,Set1/Set2/Set3/Set4 | 384種 | 13536-13539ES | ||
通用接頭(Illumina&MGI) | 板式包裝 | 雙端Index UDI接頭 | Hieff NGS® Universal Stubby UDI Primer Kit | 96種 | 12323ES |
