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為什么非要檢測(cè)rcAAV,rcAAV到底有什么風(fēng)險(xiǎn)?

2024-7-3  閱讀(197)

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腺相關(guān)病毒AAV簡(jiǎn)介

早期基因治療曾嘗試腺病毒載體,但因其免疫原性過(guò)強(qiáng)和導(dǎo)入的環(huán)狀DNA可能在細(xì)胞分裂中丟失而被AAV取代。AAV是一種無(wú)包膜單鏈DNA病毒,屬于細(xì)小病毒家族。AAV作為最早通過(guò)歐盟FDA認(rèn)證的基因治療載體,因其具有宿主范圍廣、非致病性、低免疫原性、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因、良好的擴(kuò)散性能和物理性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)中。


目前已發(fā)現(xiàn)AAV有12種亞型及120多種變型,并逐步用于基因藥物研發(fā)。rAAV攜帶的蛋白衣殼與野生型AAV幾乎相同,然而衣殼內(nèi)的基因組中編碼病毒蛋白的部分被刪除,取而代之的是治療性轉(zhuǎn)基因(transgene)。


AAV基因組中被保留的部分是ITRs,它起到指導(dǎo)基因組的復(fù)制和病毒載體組裝的作用。將編碼病毒蛋白刪除,一方面可以重組AAV攜帶轉(zhuǎn)基因的容量,另一方面可以減小病毒載體的免疫原性和細(xì)胞毒性。


通常情況下AAV不能獨(dú)立復(fù)制,只有在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒)存在時(shí)才能進(jìn)行復(fù)制。


為什么非要檢測(cè)rcAAV,rcAAV到底有什么風(fēng)險(xiǎn)?


復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)概念及法規(guī)監(jiān)管要求

在重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體生產(chǎn)過(guò)程中,轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA與rAAV會(huì)由于物理接近而導(dǎo)致rAAV載體基因組、Rep/Cap基因以及ITR序列發(fā)生非同源重組,這些重組序列被誤包后就形成了具有復(fù)制能力的AAV,即復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)。


重組腺相關(guān)病毒載體收獲液、純化后的重組腺相關(guān)病毒原液、終產(chǎn)品等都可能有復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的存在。rcAAV的存在可能不會(huì)引起rAAV產(chǎn)品的顯著安全性風(fēng)險(xiǎn),但是會(huì)增強(qiáng)或干擾治療用rAAV 的作用效果或者導(dǎo)致rAAV載體基因序列的漂移 ,影響其基因組穩(wěn)定性以及體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等。因此,規(guī)?;a(chǎn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)和產(chǎn)品放行時(shí)檢測(cè)rcAAV十分重要。


隨著病毒載體在CGT領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛,相關(guān)法規(guī)和技術(shù)原則對(duì)監(jiān)測(cè)復(fù)制型病毒提出了建議。


  • CDE 2022年發(fā)布《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》和《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》都提到病毒載體制備工藝中,復(fù)制型病毒是安全性風(fēng)險(xiǎn)關(guān)注點(diǎn)之一,應(yīng)采用經(jīng)驗(yàn)證的方法開展檢測(cè),如指示細(xì)胞培養(yǎng)法、直接qPCR法等。


  • 2020年11月歐洲的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)EMA也發(fā)布了指南“Guideline on quality,non- clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells",要求從病毒載體的設(shè)計(jì)上應(yīng)盡可能降低與野生型病毒相關(guān)的任何致病性,并盡可能將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)降到低,同時(shí)在產(chǎn)品的生產(chǎn)和應(yīng)用的不同階段進(jìn)行RCL等的控制,以保障患者的用藥安全。


  • 2020年1月28日,F(xiàn)DA發(fā)布的《關(guān)于細(xì)胞與基因治療申請(qǐng)(INDs)的化學(xué)、制造和控制(CMC)指導(dǎo)原則》中提到:對(duì)于復(fù)制型腺相關(guān)病毒rcAAV的檢測(cè),可以采用在輔助病毒存在的情況下擴(kuò)增AAV,然后進(jìn)行PCR檢測(cè)rep/ITR序列,以及在對(duì)載體制備進(jìn)行DNase消化后進(jìn)行PCR檢測(cè)rep和cap序列等。但該指導(dǎo)原則表明:不推薦用于檢測(cè)rcAAV的特定方法,藥企等應(yīng)在IND中說(shuō)明所用的檢測(cè)方法和檢測(cè)靈敏度。


為什么非要檢測(cè)rcAAV,rcAAV到底有什么風(fēng)險(xiǎn)?


復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的檢測(cè)

中美歐三國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于復(fù)制型病毒的控制階段和檢測(cè)要求基本相同,在產(chǎn)品生產(chǎn)的各個(gè)階段以及在接受基于病毒載體的基因治療的患者后續(xù)監(jiān)測(cè)中進(jìn)行檢測(cè)。并且各監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦的復(fù)制型病毒的檢測(cè)方法均是指示細(xì)胞培養(yǎng)法,該方法是復(fù)制型病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。

復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的形成主要?dú)w因于ITR中的同源序列和相鄰序列與rep/cap元件之間可能出現(xiàn)的重組事件。目前,rcAAV檢測(cè)常采用2種方法:基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)方法和qPCR快檢法(直接檢測(cè)法)。

FDA的指導(dǎo)原則建議通過(guò)全面的質(zhì)量研究確認(rèn)產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性,由于下述rcAAV的兩種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn),可考慮同時(shí)采用原理互補(bǔ)的不同方法進(jìn)行研究。


//

基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)方法

通過(guò)不斷的細(xì)胞傳代使rcAAV實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增,之后再利用qPCR或Southern-blot方法進(jìn)行檢測(cè),保證檢測(cè)到的rcAAV都具有復(fù)制能力,是目前常用的檢測(cè)方法。


但是該方法也有它的缺陷:檢測(cè)靈敏度依賴于AAV不同血清型對(duì)靶細(xì)胞的感染效率,檢測(cè)值可能低于實(shí)際值;培養(yǎng)方法和檢測(cè)平臺(tái)建立也有難度,需建易感細(xì)胞株、輔助病毒庫(kù)等,耗時(shí)長(zhǎng)且投入成本較高。


//

qPCR快檢法(直接檢測(cè)法)

對(duì)rAAV原液或終產(chǎn)品提取核酸后,直接利用qPCR法檢測(cè)rcAAV,靶標(biāo)基因一般為ITR、Rep、Cap等的連接序列,可實(shí)現(xiàn)對(duì)rcAAV上兩種基因的檢測(cè),提高準(zhǔn)確性。


其缺點(diǎn)為:檢測(cè)片段短,不能保證檢測(cè)目標(biāo)具備rcAAV復(fù)制所需完整序列,導(dǎo)致檢出的rcAAV不一定有復(fù)制能力,檢測(cè)值相較實(shí)際值偏高。


因此,針對(duì)rcAAV的檢測(cè)開發(fā)一款既能用于細(xì)胞培養(yǎng)后的終點(diǎn)檢測(cè),也能用于rcAAV直接檢測(cè)的qPCR試劑盒,對(duì)于實(shí)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法的互補(bǔ)驗(yàn)證非常有必要。


針對(duì)上述情況,翌圣生物自主研發(fā)了復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測(cè)試劑盒,基于熒光探針定量PCR原理,采用qPCR法分別檢測(cè)rAAV末端重復(fù)序列(ITR)(即參考基因Reference)和rcAAV的連接序列(即靶基因Target),實(shí)現(xiàn)對(duì)rAAV和rcAAV的同時(shí)定量檢測(cè)。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒,以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器。用于定量分析檢測(cè)各種使用AAV2血清型的重組腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行基因治療、腫瘤治療及疫苗研發(fā)等產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。


為什么非要檢測(cè)rcAAV,rcAAV到底有什么風(fēng)險(xiǎn)?



//

產(chǎn)品資質(zhì)

  • 符合法規(guī):按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗(yàn)證,符合國(guó)際機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn);

  • 配合審計(jì):產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn),有完善的審計(jì)文件;

  • 保障品質(zhì):試劑盒所需酶原料全自產(chǎn),且已產(chǎn)業(yè)化,供貨穩(wěn)定;

  • 技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累:TaqMan法有技術(shù)沉淀,使得Kit靈敏度高;

  • 專注產(chǎn)品性能:Taq酶抗體庫(kù),雙封閉抗體提高了Kit特異性、穩(wěn)定性等。


//

產(chǎn)品特點(diǎn)

  • 抗干擾性:針對(duì)復(fù)雜基質(zhì),樣本加標(biāo)回收率至少能達(dá)到70-130%;

  • 靈敏度高:定量下限(LLOQ)為2copies/μL,檢測(cè)下限(LLOD)為0.125copies/μL;

  • 精密度高:批內(nèi)重復(fù)性高CV<10%,批間差異小即中間精密度CV<15%;

  • 專屬性強(qiáng):特異性檢測(cè)目的基因序列,不受其他外源基因組DNA干擾;

  • 防干擾強(qiáng):引入內(nèi)部質(zhì)控(IC),可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等,避免假陰性。

  • 驗(yàn)證完善:參考ICH Q2(R2)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則,可提供完善的驗(yàn)證報(bào)告


//

驗(yàn)證內(nèi)容

rcAAV-2檢測(cè)驗(yàn)證項(xiàng)目

參考標(biāo)準(zhǔn)or要求

備注

1、試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品(參考品)

含有參考基因Reference和靶基因Target的質(zhì)粒DNA


2、線性范圍

標(biāo)曲范圍

參考說(shuō)明書或?qū)嶋H情況(ReferenceTarget均是2×1012×106copies/μL


R2

≥0.98P.s.本試劑盒≥0.99)

藥典要求

斜率

-3.1~-3.8P.s.本試劑盒-3.1~-3.6

藥典要求

擴(kuò)增效率

90%~110%(P.s.對(duì)應(yīng)的斜率-3.1~-3.6,行業(yè)內(nèi)要求)


3、準(zhǔn)確性

回收率

50%~150%P.s.本試劑盒70~130%)

藥典要求

4、精密度

重復(fù)性

CV<10%


中間精密度

CV<15%


5、專屬性

不受其他來(lái)源基因組DNA的干擾


6、靈敏度

定量限

ReferenceTarget均是2copies/uL


檢測(cè)限

ReferenceTarget均是0.125copies/uL


7、耐用性

儀器適用性

Thermo:ABI 7500ABI QuantStudio5;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module

上海宏石:SLAN-96S.


8、穩(wěn)定性

加速穩(wěn)定性

37℃穩(wěn)定14天,2~8℃穩(wěn)定30天


反復(fù)凍融

≥10次


有效期

-25~-15℃保存2年


9、空白限

無(wú)模板對(duì)照(NTC)

重復(fù)48qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40


陰性抽提對(duì)照(NCS)

重復(fù)48qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40



//

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品

貨號(hào)

品名

規(guī)格

樣本前處理

試劑盒

18461ES

MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit

磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(瓶裝)

25T/100T

18467ES

MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN

磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN(預(yù)封裝)

3×16T/

6×16T

核酸提取儀器

80511ES

48通道自動(dòng)化核酸提取儀

48通量


rcAAV-2檢測(cè)試劑盒

41327ES

Replication-competent AAV Serotype 2 (rcAAV2) Detection Kit

復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測(cè)試劑盒

50T/100T



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