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背景介紹
已知，生物技術藥物是指采用DNA重組技術或其他現(xiàn)代生物技術研制的蛋白質或核酸類藥物。而蛋白質藥物又包含多肽、單克隆抗體、基因工程抗體和重組疫苗等。因此，如何表達生產(chǎn)穩(wěn)定性高、純度好、質量均一的蛋白質是這些蛋白藥物的關鍵。蛋白表達系統(tǒng)的選擇對于研發(fā)和生產(chǎn)高效蛋白質產(chǎn)品就變得尤為重要了，不同的表達系統(tǒng)提供了多種途徑，以滿足對于表達水平、折疊狀態(tài)、純度和可溶性等方面的不同需求。
目前常用的表達系統(tǒng)主要有：原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)兩大類，而原核表達系統(tǒng)中較常用的是大腸桿菌表達系統(tǒng)和枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)，真核表達系統(tǒng)中較常用的是酵母表達系統(tǒng)（eg.釀酒酵母和畢赤酵母）、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)（eg.CHO細胞、HEK293細胞等）和昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)。其中，昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)被認為是具潛力的表達系統(tǒng)。
昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)
用桿狀病毒做載體，可高效表達外源基因。由于其可以對真核蛋白進行翻譯后加工等過程而被廣泛地用于真核基因的體外表達。到目前為止，已有近千種異源蛋白在此系統(tǒng)中得到高效表達。這個表達體系的主要特點是可以獲得大量抗原性、免疫原性較好的，與天然蛋白功能相似的可溶性重組蛋白。這一特點優(yōu)于細菌、酵母和哺乳動物細胞表達體系。由于這個載體系統(tǒng)的性質，使其被廣泛地應用于藥物開發(fā)、疫苗、促生長因子、抑癌基因蛋白產(chǎn)物、免疫活性分子和基因表達調(diào)控等多個領域的研究中。
由于昆蟲是桿狀病毒的自然宿主，且每種桿狀病毒都只能感染一種或幾種昆蟲，不會感染其他動物、植物及人類，所以認為在應用桿狀病毒進行研究時不需考慮其安全性問題。
桿狀病毒表達系統(tǒng)（Baculovirus expression system，BVES）就是以桿狀病毒作為外源基因載體，以昆蟲細胞作為宿主進行外源蛋白生產(chǎn)的真核表達系統(tǒng)，由轉移質粒、桿狀病毒載體和昆蟲宿主細胞系組成。BEVS最初是為了控制農(nóng)業(yè)害蟲而在20世紀70年代開發(fā)的，而隨著全球疫苗市場的擴張，其逐漸引起疫苗生產(chǎn)商的關注。BVES具有易于規(guī)?；a(chǎn)、培養(yǎng)成本低、宿主殘留對脊椎動物的生物安全性高等優(yōu)勢，現(xiàn)已作為一個成熟的外源蛋白表達平臺，在疫苗生產(chǎn)、基因治療和其他應用中發(fā)揮有效作用。
常用的桿狀病毒載體包括苜蓿蠖核型多角體病毒（AcNPV）和家蠶核型多角體病毒（BmNPV），其中以AcMN-PV研究最為深入也常用。應用較廣的昆蟲細胞系則主要有2種：草地夜蛾細胞系（Spodopteraugerda cell line，Sf），常用Sf21及其分離株Sf9細胞；粉紋夜蛾細胞系（Trichoplusia ni cell line，Tn），常用商品化的High Five™（Hi5）細胞。其中，Sf9細胞更適合于重組病毒擴增及包裝，主要用于三個領域，即：生產(chǎn)重組蛋白、rAAV載體和疫苗。國際上已有Sf9細胞基質流感疫苗批準上市，另外還有一系列Sf9細胞系參與的生物制品正處于臨床試驗階段。
風險及法規(guī)監(jiān)管要求
桿狀病毒-昆蟲細胞（Baculovirus-Sf9）表達平臺具有的優(yōu)勢，使其成為許多生物制品生產(chǎn)的有吸引力選擇。在此情況下，建立合適的檢測方法監(jiān)測生產(chǎn)工藝，控制Sf9細胞等宿主昆蟲細胞殘留核酸限度，以確保產(chǎn)品的安全性和質量已經(jīng)成為監(jiān)管機構和行業(yè)內(nèi)關注的重點。
嚴格的純化工藝可以去除一部分宿主細胞DNA（HCD）等殘留雜質成分，但產(chǎn)品中仍然可能會有HCD殘留，這些殘留的外源宿主細胞DNA會引發(fā)潛在的安全問題（如潛在致瘤性、傳染性，甚至增加免疫源性或導致突變），所以HCD檢測項目是生物制品生產(chǎn)工藝中重要的質量檢測指標之一。各國的藥典法規(guī)也相繼出臺了針對生物制品中外源宿主DNA殘留量限度的規(guī)定。
《中國藥典》2020年版三部規(guī)定，以細胞基質生產(chǎn)的生物制劑外源宿主細胞DNA殘留量不能超過100pg/劑。
《歐洲藥典》（EP10.0）通則規(guī)定的生物制品殘留DNA限度大多為不超過10ng/劑。
美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布的指導原則中指出生物制品宿主細胞DNA殘留限度不得超過100pg/劑，對于大劑量的生物制品（如單克隆抗體），根據(jù)其殘留DNA來源及給藥途徑，DNA殘留量可放寬至10ng/劑。
Sf9和桿狀病毒(AcNPV)殘留DNA的檢測
現(xiàn)行各國藥典中生物制品殘留DNA檢測方法主要有4種：雜交法、閾值法、熒光染料法和定量PCR法等。其中，qPCR法具有的靈敏度、序列特異性和準確性，可為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質量控制方面提供可靠的檢測手段，現(xiàn)也已成為各生物制品企業(yè)檢測方法。
針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了Sf9和桿狀病毒（AcNPV）DNA殘留檢測試劑盒，基于探針法熒光定量PCR原理，采用多重qPCR方法分別檢測Sf9和桿狀病毒（AcNPV）殘留DNA，Sf9定量限可達1fg/μL，桿狀病毒（AcNPV）定量限可達7copies/uL。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。
產(chǎn)品資質
符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗證，符合國際機構的標準；
配合審計：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質量體系標準，有完善的審計文件；
保障品質：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn)，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定；
技術經(jīng)驗積累：TaqMan法有技術沉淀，使得Kit靈敏度高；
專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性、穩(wěn)定性等。
產(chǎn)品特點
抗干擾性：針對復雜基質，樣本加標回收率至少能達到70-130%；
靈敏度高：定量下限(LLOQ)分別為Sf9 1fg/μL，AcNPV 7copies/uL；
精密度高：批內(nèi)重復性高CV＜10%，批間差異小即中間精密度CV＜15%；
專屬性強：特異性檢測Sf9和AcNPV殘留DNA，不受其他外源基因組DNA干擾；
防干擾強：引入內(nèi)部質控(IC)，可排除樣本干擾、反應配制異常等，避免假陰性。
驗證完善：參考ICH Q2（R2）分析方法驗證指導原則，可提供完善的驗證報告。
驗證內(nèi)容
| rcAAV-2檢測驗證項目 | 參考標準or要求 | 備注 | |
| 1、試劑盒標準品（參考品） | 含有參考基因Reference和靶基因Target的質粒DNA | ||
| 2、線性范圍 | 標曲范圍 | 參考說明書或實際情況（Reference和Target均是2×101～2×106copies/μL） | |
| R2 | ≥0.98（P.s.本試劑盒≥0.99） | 藥典要求 | |
| 斜率 | -3.1~-3.8（P.s.本試劑盒-3.1~-3.6） | 藥典要求 | |
| 擴增效率 | 90%~110%（P.s.對應的斜率-3.1~-3.6，行業(yè)內(nèi)要求） | ||
| 3、準確性 | 回收率 | 50%~150%（P.s.本試劑盒70~130%） | 藥典要求 |
| 4、精密度 | 重復性 | CV＜10% | |
| 中間精密度 | CV＜15% | ||
| 5、專屬性 | 不受其他來源基因組DNA的干擾 | ||
| 6、靈敏度 | 定量限 | Reference和Target均是2copies/uL | |
| 檢測限 | Reference和Target均是0.125copies/uL | ||
| 7、耐用性 | 儀器適用性 | Thermo：ABI 7500、ABI QuantStudio5； | |
| Bio-Rad：CFX96 Optic Module； | |||
| 上海宏石：SLAN-96S. | |||
| 8、穩(wěn)定性 | 加速穩(wěn)定性 | 37℃穩(wěn)定14天，2~8℃穩(wěn)定30天 | |
| 反復凍融 | ≥10次 | ||
| 有效期 | -25~-15℃保存2年 | ||
| 9、空白限 | 無模板對照（NTC） | 重復48次qPCR擴增曲線CT≥40 | |
| 陰性抽提對照（NCS） | 重復48次qPCR擴增曲線CT≥40 | ||
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品 | 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit 磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18467ES | MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預封裝) | 3×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80511ES | 48通道自動化核酸提取儀 | 48通量 |
Sf9和AcNPV殘留DNA 檢測試劑盒 | 41330ES | Sf9&AcNPV DNA Residue Detection Kit Sf9和桿狀病毒（AcNPV）DNA殘留檢測試劑盒 | 50T/100T |
