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不知各位小伙伴在做熒光定量qPCR實驗的時候有沒有遇到過以下這些情況？
主峰左邊有雜峰，疑似引物二聚體
主峰右邊有雜峰，疑似非特異擴增
基因表達(dá)無差異
每當(dāng)出現(xiàn)這些情況，就意味著可能要重新做實驗。為確保下一次實驗不出錯，了解其原因十分重要，可能是體系污染導(dǎo)致，也可能是擴增特異性不足導(dǎo)致。在這里小翌教大家從引物設(shè)計的角度提升擴增特異性！
在進(jìn)行qPCR引物設(shè)計時，相信有不少小伙伴聽過類似“跨內(nèi)含子設(shè)計"的要求，那么，要跨內(nèi)含子設(shè)計是啥？為什么要跨內(nèi)含子設(shè)計呢？
以人基因組來說，平均每個基因有8.8個外顯子和7.8個內(nèi)含子，80%的外顯子長度小于200bp，少于10%的內(nèi)含子長度在1100bp以上，不到0.01%的內(nèi)含子長度小于20bp。
我們在進(jìn)行一些熒光定量qPCR實驗之前，需要提取RNA和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA作為模板用于分析基因表達(dá)情況。故在DNA序列上設(shè)計引物需避開內(nèi)含子序列區(qū)域，選用外顯子區(qū)域序列用于引物設(shè)計?？吹竭@，有小伙伴會有疑問，那為啥不叫“外顯子設(shè)計"或者“去內(nèi)含子設(shè)計"呢，為啥要稱為“跨內(nèi)含子設(shè)計"？
是的，引物還需要跨內(nèi)含子，在設(shè)計引物時需要讓一端引物或者兩端引物跨越內(nèi)含子，否則熒光定量qPCR的熔解曲線可能出現(xiàn)雙峰或者多峰。
在單個外顯子上進(jìn)行上下游引物設(shè)計
在這種情況下，由于產(chǎn)物序列一致且大小一致，從熔解曲線上難以分辨，看上去都是單一的熔解峰，但是在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時，往往會有一種感覺，就是基因表達(dá)無差異或者差異結(jié)果不穩(wěn)定。
在兩個外顯子上進(jìn)行上下游引物設(shè)計
在這種情況下，產(chǎn)物差距就比較大了，基因組DNA(gDNA)擴增產(chǎn)物較cDNA擴增產(chǎn)物更長，熔解溫度(Tm值)更大，在熔解曲線上表現(xiàn)出來則是主峰右側(cè)的雜峰。當(dāng)然還有一種情況，當(dāng)以gDNA為模板所需擴增的片段很長，難以擴增，最終產(chǎn)物相對單一，熔解曲線峰也是相對單一的。
建議的上下游引物設(shè)計方式
引物跨內(nèi)含子設(shè)計后，對于引物序列本身還有什么要求呢？接下來小翌給大家分享引物設(shè)計原則~
qPCR引物設(shè)計原則
參考項 | 標(biāo)準(zhǔn)參考 |
產(chǎn)物長度 | 80-300bp |
引物長度 | 17-25 base |
GC含量 | 40-60%（45-55%為最佳） |
Tm值 | 上游引物F和下游引物R的Tm值不能相差太大，最好不超過1℃。 |
引物序列 | A、T、C、G整體分布盡量均勻。避開T/C或A/G的連續(xù)結(jié)構(gòu)。 |
3末端序列 | 避免GC rich或AT rich。3端堿基最好為G或C，盡量避免末端堿基為T。 |
互補序列 | 避開引物內(nèi)部或兩條引物之間有3個堿基以上的互補序列。 兩條引物間的3末端避開有2個堿基以上的互補序列。 |
特異性 | 使用BLAST檢索確認(rèn)引物的特異性。 |
產(chǎn)物長度
產(chǎn)物擴增長度為80-200bp，必要時可選擇加長。通常擴增效率隨著擴增產(chǎn)物長度增大而減小。但是不能太短，否則難以區(qū)分是引物二聚體還是擴增產(chǎn)物。
末端序列
引物末端最好是G或C，因為GC堿基之間是三個氫鍵連接，能夠保證引物和模板連接的穩(wěn)定性。
互補序列
引物3端通常是DNA聚合酶延伸的起點，如果兩條引物在3端互補性過高，則更易形成引物二聚體，從而降低PCR的擴增效率和特異性。
若引物自身的互補性高，則會發(fā)生自身退火，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或者兩條一樣的引物形成二聚體，從而降低PCR的擴增效率和特異性。
聊完了原則上qPCR引物如何設(shè)計之后，接下來讓我們進(jìn)入小伙伴們最為關(guān)注的實戰(zhàn)操作。在這里小翌給大家介紹三種方式設(shè)計qPCR引物！
Primer3Plus
Load server settings 選擇qPCR，后上傳設(shè)計引物的序列或粘貼需要設(shè)計引物的序列。按照自己的引物設(shè)計需求，選擇使用排除的區(qū)域Excluded Regions、目的擴增區(qū)域Targets和包含區(qū)域Included Region。
點擊General Settings按照熒光定量qPCR引物設(shè)計原則進(jìn)行相關(guān)參數(shù)設(shè)置，例如擴增產(chǎn)物長度Primer Size Ranges、引物長度Primer Size、Tm值Primer Tm、GC含量Primer GC%。完成相關(guān)參數(shù)設(shè)置后，點擊右上方綠色按鈕Pick Primers，即可獲得相關(guān)引物。
獲得相關(guān)引物序列后，到NCBI blast 進(jìn)行引物特異性驗證。
Primerbank
它是哈佛大學(xué)的一個PCR引物數(shù)據(jù)庫，包含 306,800 多種引物，涵蓋大多數(shù)已知的人類和小鼠基因。通過 Real Time PCR 測試了與 27681 個小鼠基因相對應(yīng)的 26855 對引物，然后對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和測序。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，設(shè)計成功率為 82.6%（22187 對引物）。
首先在NCBI上找到目的基因的gene ID，例如，這里選用老鼠基因IL6的gene ID 16193。
Search by選擇 NCBI Gene ID，Species選擇Mouse，輸入16193，點擊Submit，即可獲得相關(guān)引物。
相關(guān)引物還有已驗證的可視化結(jié)果。
NCBI
打開NCBI，選擇“Gene"，輸入想要檢測的基因名稱，我們以人基因“ALAD"為例。
會出現(xiàn)很多搜索結(jié)果，我們選擇需要的種屬來源，即“human"，如果你知道Gene ID（每個基因有且只有一個特定的ID，類似于人的），也可以根據(jù)Gene ID來選擇。這里我們選擇搜索結(jié)果中的第一個。
點開之后，會出現(xiàn)很長的頁面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）"欄下的NM編號，不同的NM編號，代表不同的isoform。選擇想要檢測的那一個。
確定NM號點擊后，可以看到這個isoform的一些基本信息。
例如：gene代表基因長度3129bp，CDS代表編碼蛋白區(qū)域149-1141bp。
以及此基因的序列，如下圖所示。此序列就是設(shè)計引物時對應(yīng)的模板。
了解完我們所需的isoform后，我們可以點擊右側(cè)的“Pick Primers"，就能直接進(jìn)入Primer-BLAST的頁面進(jìn)行引物設(shè)計了。
在彈出來的界面里粘貼模板序列或者輸入基因序列號。另外需要設(shè)置“上下游引物位置"和“擴增子長度"。最主要的設(shè)置就是這兩點了，另外還有“物種名稱"、“數(shù)據(jù)庫"等其他選項可以設(shè)置。
設(shè)置好之后，點擊頁面左下角的“Get Primers"。
多對引物，選擇合適的引物即可。
獲得相關(guān)引物序列后，到NCBI blast進(jìn)行引物特異性驗證。
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