疫苗是將病原微生物（如細(xì)菌、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。自1798年英國醫(yī)生琴納研發(fā)牛痘疫苗以來，疫苗作為預(yù)防性藥物，在患病之前給予人體抵御疾病的能力，比治療性藥物意義更加重大。早期疫苗大多預(yù)防的是嚴(yán)重的、流行度高的傳染性疾病，例如牛痘疫苗預(yù)防的天花曾經(jīng)在1900-1908年間在全球殺死5億人，十四世紀(jì)的鼠疫曾經(jīng)導(dǎo)致歐洲三分之一的人口死亡。疫苗的出現(xiàn)，終結(jié)了這種毀滅性的災(zāi)難，將人類從生存威脅中解放出來，功不可沒。

根據(jù)Statista統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2023年中國疫苗市場規(guī)模為1017.7億元，其中非免疫規(guī)劃疫苗市場規(guī)模973.6億元，在疫苗市場占比95.67%；免疫規(guī)劃疫苗市場規(guī)模44.1億元，占比4.33%。這意味著疫苗市場規(guī)模邁入千億門檻，已超越不少傳統(tǒng)大適應(yīng)證治療用藥的市場規(guī)模。

疫苗的種類多樣，分類方法也有多種。按國家標(biāo)準(zhǔn)，可以分為一類疫苗（免疫規(guī)劃疫苗，政府免費提供并且公民必須接種，如乙肝疫苗、卡介苗等））和二類疫苗（非免疫規(guī)劃疫苗，公民自愿接種且費用自行承擔(dān)，如HPV疫苗、流感疫苗等）。按照制備工藝，可以分為減毒活疫苗、滅活疫苗、類毒素疫苗、多糖疫苗、多糖蛋白（結(jié)合）疫苗、重組蛋白疫苗、核酸疫苗和病毒載體疫苗等。

疫苗從早期研發(fā)到獲批上市需要經(jīng)歷多個階段，每個階段都存在極其復(fù)雜的不確定性，需要對其中多個關(guān)鍵點進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，從而確保最終產(chǎn)品的安全性和有效性。

圖1.疫苗研發(fā)及生產(chǎn)流程中翌圣質(zhì)控產(chǎn)品推薦

去除宿主細(xì)胞雜質(zhì)是細(xì)胞基因治療藥物在內(nèi)的生物制藥產(chǎn)品生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟，其中宿主細(xì)胞殘留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全問題成為關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)。在此情況下，建立合適的檢測方法監(jiān)測生產(chǎn)工藝，控制宿主細(xì)胞殘留核酸限度，以確保產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量已經(jīng)成為監(jiān)管機(jī)構(gòu)和行業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點。

• 《中國藥典》2020年版三部規(guī)定，以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑外源宿主細(xì)胞DNA殘留量不能超過100pg/劑，以細(xì)菌或真菌基質(zhì)（酵母、大腸桿菌等）表達(dá)的生物制品中DNA殘留量不超過10ng/劑；

• 《歐洲藥典》（EP10.0）通則規(guī)定的生物制品殘留DNA限度大多為不超過10ng/劑；

• 美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布的指導(dǎo)原則中指出生物制品宿主細(xì)胞DNA殘留限度不得超過100pg/劑，對于大劑量的生物制品（如單克隆抗體），根據(jù)其殘留DNA來源及給藥途徑，DNA殘留量可放寬至10ng/劑。

此外，《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。目前市場上對宿主細(xì)胞殘留DNA檢測，主要采用熒光探針qPCR方法，qPCR法具有高的靈敏度、序列特異性和準(zhǔn)確性，可為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供可靠的檢測手段，現(xiàn)也已成為各生物制品廠家檢測方法。

翌圣生物自主研發(fā)的CHO宿主細(xì)胞殘留DNA的qPCR法檢測試劑盒，可快速高效檢測生物藥中宿主DNA殘留量。

圖3. CHO DNA (3G)標(biāo)曲范圍3fg/μL~300pg/μL，擴(kuò)增效率為99.29%，各濃度檢測值CV<15%

除需對DNA的殘留量進(jìn)行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關(guān)風(fēng)險因素的重要指標(biāo)。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp可能會有一定的致病性，且殘留DNA片段越大，生物制品的風(fēng)險等級越高。

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》的行業(yè)指南中建議將非致瘤性連續(xù)細(xì)胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。

2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）中也明確指出需對DNA殘留量和殘留片段大小進(jìn)行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。

目前，行業(yè)內(nèi)對于殘留宿主細(xì)胞DNA片段分析，主要是利用毛細(xì)管電泳的方法。研究者們開發(fā)了一種基于毛細(xì)管凝膠電泳與敏感激光誘導(dǎo)熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小，實驗表明，大多數(shù)宿主細(xì)胞殘留DNA片段大小為50～2 000bp。除了毛細(xì)管電泳法外，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進(jìn)行生物制品中生產(chǎn)用細(xì)胞相關(guān)的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了CHO&Vero殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設(shè)計了四種不同的擴(kuò)增片段（幾十bp、100多bp、200多bp、500多bp），用于定量檢測樣本中宿主細(xì)胞殘留DNA片段的大小分布情況。

圖4. 宿主細(xì)胞中殘留DNA片段分析檢測流程圖

生物制品中HCP殘留含量通常被認(rèn)為是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測的重要評價指標(biāo)，也是產(chǎn)品的重要質(zhì)控指標(biāo)。各國法規(guī)都有涉及HCP的論述，要求必須對生物藥品進(jìn)行分析和純化，以將宿主細(xì)胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了包括CHO和畢赤酵母宿主細(xì)胞在內(nèi)的多款HCP蛋白殘留量檢測試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測。

圖5. 翌圣CHO和畢赤酵母HCP ELISA試劑盒產(chǎn)品特點

生物制品生產(chǎn)中經(jīng)常會涉及到細(xì)胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)，在這些培養(yǎng)中胎牛血清被廣泛應(yīng)用，為細(xì)胞生長提供必須的營養(yǎng)成分，而胎牛血清中就包含了一定量的BSA（Bovine serum albumin，牛血清白蛋白）?？紤]到生產(chǎn)的藥物的安全性，目前疫苗、抗體藥物、組織工程產(chǎn)品以及細(xì)胞&GCT等生物制品的生產(chǎn)過程中，逐漸使用無血清培養(yǎng)基來替代含血清培養(yǎng)基，從而減少可能由血清帶來的病毒污染等潛在危害。其中，無血清培養(yǎng)基多采用各種可以替代血清功能的生物大分子配制而成，例如牛血清白蛋白（BSA）、轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素。由此，無論使用含血清培養(yǎng)基還是無血清培養(yǎng)基，都會有BSA。雖然在生產(chǎn)中經(jīng)過純化等步驟去除了大部分的雜質(zhì)蛋白，但仍然會有微量的外源蛋白（如BSA等）存在于最終的生物制品中。

BSA作為外源蛋白進(jìn)入人體后可能引起嚴(yán)重過敏反應(yīng)，從而影響生物制品的安全性。2020版《中國藥典》（三部）對各種疫苗中BSA的殘留量進(jìn)行了明確規(guī)定，基本是不高于50 ng/mL或者不高于50 ng/劑。

翌圣生物依托相關(guān)法規(guī)，從市場需求出發(fā)，自主研發(fā)了牛血清白蛋白（BSA）殘留量檢測試劑盒。試劑盒采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及辣根過氧化物酶（HRP）信號放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測樣本中牛血清白蛋白殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測。

表1. 翌圣BSA ELISA試劑盒產(chǎn)品性能參數(shù)

金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁中的A蛋白（Staphylococal ProteinA，SPA）又稱Protein A，是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，42kDa，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結(jié)合，通常在大規(guī)模抗體制備中用于純化IgG。在抗體藥生產(chǎn)中，下游親和層析過程中Protein A會不可避免的與目標(biāo)抗體蛋白一起被洗脫下來，從而在最終純化步驟中產(chǎn)生Protein A殘留。這種雜質(zhì)會嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量、藥效以及安全性。因此，國內(nèi)外法規(guī)對殘留Protein A檢測以及殘留量標(biāo)準(zhǔn)均有相關(guān)文件出臺。

《中華人民共和國藥典》2020年版第三部《人用重組單克隆抗體制品總論》3.2.4 工藝相關(guān)雜質(zhì)中提出“采用適宜的方法對供試品宿主蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞和載體DNA、蛋白A及其他工藝相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行檢測"。

USP<130> PROTEIN A QUALITY ATTRIBUTES中提到希望廠家能夠在純化工藝中將脫落的protein A清除，生產(chǎn)工藝也需要進(jìn)行相應(yīng)驗證。

關(guān)于Protein A檢測方法和殘留限度，2020年版中國藥典三部《尼妥珠單抗注射液》3.1.3.3 蛋白質(zhì)A殘留量中提出“用酶聯(lián)免疫吸附法（通則3429）測定，蛋白質(zhì)A殘留量應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.001%"。

目前，基于ELISA的殘留檢測基本上已被應(yīng)用于工藝研發(fā)和驗證過程中以確保在蛋白A親和層析之后的過程步驟中能夠有效去除殘留蛋白A。翌圣自主研發(fā)的Protein A ELISA Kit正是采用ELISA方法，通過試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品對樣品中的殘留protein A進(jìn)行定量檢測。

圖6. 翌圣生物ELISA法檢測Protein A殘留量的實驗過程

在治療性藥物（如抗體、病毒載體藥物、疫苗等）的生產(chǎn)及工藝流程中，核酸雜質(zhì)的去除至關(guān)重要。UltraNuclease全能核酸酶，又稱為廣譜核酸酶、非限制性核酸內(nèi)切酶，其能夠在多種實驗條件下切割和降解各種形式的DNA和RNA，廣泛用于去除生物制品中的核酸。

在正常的純化步驟中，全能核酸酶作為雜質(zhì)很容易被去除。為檢測全能核酸酶具體殘留量，行業(yè)內(nèi)常采用UltraNuclease作為標(biāo)準(zhǔn)品，開發(fā)與之配套的ELISA試劑盒。

翌圣自主研發(fā)的UCF.ME® UltraNuclease ELISA Kit正是采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測（夾心ELISA）原理，能夠準(zhǔn)確檢測樣本中全能核酸酶的殘留量，該試劑盒在線性、重復(fù)性、回收率及特異性等方面均表現(xiàn)穩(wěn)定。

圖7. 翌圣核酸酶ELISA試劑盒實驗原理（雙抗夾心ELISA法）