活體成像試劑（D-Luciferin and Coelenterazine）
— — 生物化學(xué)發(fā)光檢測法（熒光素酶）
背  景：
活體成像技術(shù)（optical in vivo imaging）目前主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)，生物發(fā)光法是基于熒光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化學(xué)發(fā)光的原理，將體外能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株植入動物體內(nèi)，與后期注射入體內(nèi)的底物發(fā)生反應(yīng)，利用光學(xué)系統(tǒng)檢測光強度，間接反映出細胞數(shù)量的變化或細胞的定位。這項技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，zui常用的有腫瘤或疾病動物模型的建立，并可用于病毒學(xué)研究、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究等。
原  理：
常見的熒光素酶有兩種，分別是螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，編碼基因是luc）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，編碼基因是Rluc），前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它們共同的作用原理是在ATP和熒光素酶的催化作用下，底物被氧化發(fā)光（不同底物光的顏色和波長不同），當?shù)孜镞^量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性。
產(chǎn)  品：
化學(xué)發(fā)光底物1：D-Luciferin
美國Goldbio公司提供幾種常用類型的D-Luciferin，每批試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量驗證（經(jīng)9次獨立的HPLC和FTIR標準法監(jiān)測）和發(fā)光效率檢測，確保客戶每次試驗的高重復(fù)性和成功性。所有產(chǎn)品都可用于體內(nèi)成像分析和體外化學(xué)發(fā)光檢測實驗。Goldbio的D-Luciferin是合成的螢火蟲熒光素，結(jié)構(gòu)與promega公司提供的甲蟲熒光素一致，是水溶性的螢火蟲熒光素酶底物。
（1）D-Luciferin, Sodium Salt/D熒光素鈉鹽
分子式：NaC₁₁H₇N₂O₃S₂·H₂O  分子量：320.32 g/mol   純度：純（99.7%）
應(yīng) 用：1）體外化學(xué)發(fā)光分析（in vitro）；2）活體成像實驗（in vivo）；3）高靈敏度ATP分析；
步 驟：
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 體外生物發(fā)光檢測
1）用33.3 mL蒸餾水溶解1.0 gD-熒光素鈉鹽，配制成100 mM的儲存液（200×，濃度30mg/ml）?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。
2）用組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)。
3）去除培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基。
4）待圖像分析前，向細胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析。
Protocol 2：In vivo analysis / 活體成像分析
1）用無菌的PBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-熒光素鈉鹽工作液(15mg/mL)，0.2um濾膜過濾除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）注射量取決于注射方式，具體如下：

3）注射入體內(nèi)5-10分鐘后，進行成像分析。
產(chǎn)品報價：

（2）D-Luciferin, Potassium Salt/D-熒光素鉀鹽;
分子式：NaC₁₁H₇N₂O₃S₂·H₂O    分子量：320.32 g/mol   純度：純（99.7%）
應(yīng)用：1）活細胞、組織或生物體內(nèi)luc標記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達的成像分析；
       2）廣泛用于報告基因分析，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測分析；
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 體外生物發(fā)光檢測
1）配制成100 mM的儲存液（200×，濃度30mg/ml）?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。
2）用預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲存液，配制工作液(終濃度150μg/mL)。
3）去除培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基直至無殘留。
4）圖像分析前立即向細胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析（或者細胞放在37℃短時間孵育后檢測可增強信號）。
Protocol 2：In vivo analysis in mice / 小鼠活體成像分析
1）用無菌的DPBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液(15mg/mL)，0.2um濾膜過濾除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）按10 μL/g體重的濃度向每支小鼠注射相應(yīng)量的15mg/mL熒光素溶液；
3）腹腔注射10-15 min后進行成像分析。（對每只動物模型做熒光素動力學(xué)研究以確定峰值信號獲取時間）
產(chǎn)品報價：

（3）D-Luciferin Firefly,free acid/D-螢火蟲熒光素
分子式：C₁₁H₈N₂O₃S₂  分子量：280.330 g/mol  外觀：白色至淺黃色粉末
溶解：0.25%濃度溶解于甲醇，形成近乎無色至淺黃色的清夜
保存：-15°C 避光
應(yīng)用：1）活細胞、組織或生物體內(nèi)luc標記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達的成像分析；
      2）廣泛用于報告基因分析，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測分析；
產(chǎn)品報價：

使用GBT公司熒光素（Luciferin）發(fā)表的文獻:
1. Barth et al. Molecular Therapy. 2008, 16. 957-964.
2. Mahller et al. Cancer Research. 2008, 68 (4). 1170-1179.
3. Marques et al. Journal of Neurovirology. 2008, 14 (3). 229-238.
4. Stish et al. J. Neurooncol. 2008, 61 (1). 51-61.
5. Zhang et al. Cancer Research. 2007, 67. 9389-9397. 6. Baia, G. et al, Brain Pathology, 2007, 18 (2), 172-179.
7. Barth, A. et al, Molecular Therapy, 2008, 16 (5), 957-964.
8. Su Y. et al. Clinical and Experimental Metastasis, 2009
化學(xué)發(fā)光底物2：Coelenterazine
美國Goldbio提供三種coelenterazine類似物，分別是Coelenterazine，Coelenterazineh，Coelenterazine 400a。雖然三種都可用于相同實驗，但是得到的結(jié)果有差異。
Coelenterazine：普遍認為是天然的腔腸熒光素，是海腎熒光素酶（Rluc）的作用底物，具有許多用途?？捎糜跈z測活細胞中鈣離子濃度，基因報告分析，BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）研究，ELISA，HTS，組織或細胞中超氧陰離子和過亞硝酸鹽的化學(xué)發(fā)光檢測。
Coelenterazine h:與Renilla熒光素酶或Gaussia熒光素酶使用具有一定的局限性。體外研究中比其他類似物更適合與鈣離子激活發(fā)光蛋白共用。據(jù)報道，Coelenterazine h的發(fā)光強度高于天然腔腸熒光素10-20倍，因此是用來檢測鈣離子濃度微小變化的有力工具。
Coelenterazine 400a: 是BRET研究中Rluc的底物，此腔腸素衍生物在390 nm和400nm之間發(fā)藍色光，對GFP acceptor的光發(fā)射干擾zui小。
（1）Coelenterazine（天然腔腸熒光素）
分子式：C₂₆H₂₁N₃O₃    分子量: 423.48 g/mol   純度：95%  保存：-15°C避光，保存在惰性氣體下
Protocol：發(fā)光檢測實驗
1）使用管光度計室溫下定量檢測發(fā)光情況，每個樣品做三個平行；
2）加入底物10s內(nèi)立即檢測，“integration time”為1 s；
3）對于細菌表達Gluc系統(tǒng)，甲醇溶解底物腔腸素制備10 mM儲存液，終濃度為10μmol/L。儲存液-20 °C保存，工作液制備過程需避光并置于冰上。
產(chǎn)品報價：

（2）Coelenterazine 400 a/腔腸素400a
分子式：C₂₆H₂₁N₃O   分子量：: 391.48 g/mol     純度：95%
儲存液制備：
1）開封前將瓶子放到室溫溫育，以避免產(chǎn)品發(fā)生任何的冷凝；
2）用125 μL無水乙醇溶解50 μg Coelenterazine 400 a，zui終濃度是0.4μg/μL. ，輕輕混勻；（注：避免用DMSO或其他溶劑來溶解腔腸素400a，因為試劑可能被氧化）
3）分裝后避光保存在-20°C，保持干燥；
產(chǎn)品報價：

（3）Coelenterazine h/ 腔腸素h（from Caliper LifeScience Inc.）
RediJectCoelenterazineh為即用的注射型生物發(fā)光底物，特別設(shè)計用于體內(nèi)成像研究。通過zui小化產(chǎn)品成分的變化，zui小化凍融次數(shù)和嚴格控制不同批次的產(chǎn)品，使用Caliper公司的Coelenterazine h能確?？蛻舻玫礁咧貜?fù)性的結(jié)果。
優(yōu)  點：
◆預(yù)制配方，不同批次間嚴格控制特別設(shè)計用于體內(nèi)研究；
◆即用型產(chǎn)品通過zui小化預(yù)成像準備步驟，減少時間和精力；
◆每瓶可用于5只動物的成像研究；（10 瓶/kit）
◆經(jīng)IVIS成像系統(tǒng)驗證，控制體內(nèi)成像質(zhì)量；
顏色：黃色溶液（溶于丙二醇/檸檬酸鹽）
濃度：150 μg/mL （10瓶無菌溶液，每瓶含1.2 mL濃度為150 μg/mL的Coelenterazine h ）
保存： Store at ≤ -70 °C。
使用及注射劑量：
開始實驗前，37 °C水浴鍋解凍，避免重復(fù)凍融。靜脈注射(i.v.)或腹腔注射(i.p.)。

1. 靜脈注射：推薦使用劑量15 μg/mouse(100 μL/mouse），用1 ml注射器直接從瓶內(nèi)吸取溶液，然后用25 gauge或更高的針頭注射入小鼠體內(nèi)。盡快成像檢測以獲得峰值信號。
2. 腹腔注射：推薦劑量是30 μg/mouse (200 μL/mouse)，方法同上。

應(yīng)用實例：
   
                                      
Figure 1. RedijectCoelenterazine has been optimized for in vivo use with IVISimaging systems. (A) 5 pmol BRET Qdot 700* were injected intravenouslyin a nu/nu mouse. 10 minutes post BRET Qdot injection 15 μg/mouseCoelenterazine h was injected intravenously. Chart shows peak signal wasobserved right after injection at ~ 22 seconds followed by rapidclearance. Images were taken with IVIS kinectic. (B) 1,2 and 4 pmol BRETQdot 655 were injected subcutaneously in a nu/nu mouse. 10 minutes postBRET Qdot injection 10 μg/mouse Coelenterazine was injectedintraperitoneally. Chart shows that peak signal was reached around 27minutes post i.p. injection of Coelenterazine.
產(chǎn)品報價：