一氣呵成，Hieff Clone攻無不“克”

------克隆新思路，給你好看

Yeasen Hieff CloneTM 一步法克隆試劑盒榮登SCI*期刊:《Cell》《Science》.

詳情點(diǎn)擊：http://www.yeasen。。ｃｏｍ/CompanyNews/1930.htm

          http://www.yeasen。。ｃｏｍ/CompanyNews/1951.htm

基于限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的經(jīng)典分子克隆技術(shù)，易出現(xiàn)假陽性，克隆效率不高。此外，該技術(shù)受到多種實(shí)驗(yàn)因素的限制，包括酶切位點(diǎn)的選擇、插入片段制備繁瑣、T4 DNA連接酶序列的偏好性、連接反應(yīng)時(shí)間長等。

提高克隆效率的關(guān)鍵，增加配對(duì)堿基數(shù)

圖1. 幾種克隆方法連接效率的比較

翊圣生物經(jīng)數(shù)年潛心研究，精益求精。摸索與優(yōu)化反復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了“末端同源重組技術(shù)”由理論到應(yīng)用的升級(jí)，研發(fā)出Hieff Clone^TM系列克隆產(chǎn)品。該系列產(chǎn)品克隆效率顯著提升，可達(dá)95%以上。基于同源重組的方式，該系列產(chǎn)品無需考慮酶切位點(diǎn)，適用于任何載體和任意片段的連接。同時(shí)兼具連接反應(yīng)時(shí)間短（20 min）、操作簡單等優(yōu)勢(shì)。

非凡匠心，帶來*品質(zhì)

翊圣生物在成熟的工具酶表達(dá)純化平臺(tái)基礎(chǔ)上，獲得高純度重組酶，并反復(fù)優(yōu)化重組酶反應(yīng)微環(huán)境，保證Hieff Clone^TM克隆試劑盒的*品質(zhì)。它可以將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。Hieff Clone^TM克隆試劑盒簡便、快速、，是無縫克隆的。

● 無需考慮酶切位點(diǎn)：不受插入片段酶切位點(diǎn)的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。

● 設(shè)計(jì)簡單：在插入片段的PCR擴(kuò)增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。

● 快速：50℃，20 min即可完成重組反應(yīng)?？寺￡栃月士蛇_(dá)95%以上。

● 應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結(jié)合Canace高保真酶，應(yīng)用于定點(diǎn)突變。

方法對(duì)比

Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆試劑盒分為單片段克隆和多片段克隆試劑盒，實(shí)驗(yàn)流程見下圖。

圖2：Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆試劑盒進(jìn)行單片段和多片段克隆實(shí)驗(yàn)流程圖。

①線性化載體的制備：酶切或PCR制備線性化載體。②插入片段的制備：在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右載體末端同源序列；PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段。③重組反應(yīng)：按比例混合線性化載體和目的DNA片段進(jìn)行重組，50℃反應(yīng)20 min。④轉(zhuǎn)化、涂板：將重組產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后涂平板。挑取克隆。

★ 單片段重組

圖3：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長度的單片段基因。

A-D：重組轉(zhuǎn)化平板。E：插入片段和載體濃度檢測(cè)電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb，載體與插入片段摩爾比：1:3，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。

★ 多片段輕松重組

圖4：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行三片段克隆。

A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：插入片段和載體濃度檢測(cè)電泳圖。C：PCR方法鑒定每個(gè)單片段和zui終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個(gè)插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。

★ 載體與插入片段摩爾比1:3左右zui適

圖5：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit進(jìn)行單片段和載體不同摩爾濃度比例重組克隆測(cè)試。

A-C：重組轉(zhuǎn)化平板。載體與插入片段的分子摩爾數(shù)比分別是1:2（A），1:3（B）和1:4（C），重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。

★ 重組反應(yīng)時(shí)間20-30 min*

圖6：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit進(jìn)行不同重組反應(yīng)時(shí)間克隆測(cè)試。

A-C：重組轉(zhuǎn)化平板。重組反應(yīng)時(shí)間分別是20 min（A），25 min（B）和30 min（C），重組反應(yīng)溫度：50℃。

• 率重組

實(shí)驗(yàn)信息：載體大小：10217 bp；目的片段大?。?352 bp。

圖7：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆，克隆陽性率100%。

A：陰性對(duì)照轉(zhuǎn)化平板。B：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。C：1和2分別為原始載體和線性化載體濃度檢測(cè)電泳圖。D：目的片段的濃度檢測(cè)電泳圖。E：目的片段的菌落PCR鑒定電泳圖。F：1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖，2為原始質(zhì)粒酶切對(duì)照?qǐng)D。M：DL10000. (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)) 

• 長片段重組

實(shí)驗(yàn)信息：載體大小：8000 bp，目的片段大?。?500 bp。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

圖8：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆。

A：陰性對(duì)照轉(zhuǎn)化平板。B：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。C：載體和目的片段的濃度檢測(cè)電泳圖。D：菌落PCR鑒定電泳圖，箭頭指示目的條帶。 M₁：Marker Ⅲ；M₂：100 bp DNA ladder。(仁濟(jì)醫(yī)院)

• 短片段重組

實(shí)驗(yàn)信息：載體大小：5500 bp；目的片段大?。?9 bp。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

圖9：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆。

A：陰性對(duì)照轉(zhuǎn)化平板。B：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。C：載體濃度檢測(cè)電泳圖。D：克隆測(cè)序?qū)Ρ葓D，為陽性結(jié)果。M：Trans 2K plus II DNA ladder.(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)

• 多片段重組

實(shí)驗(yàn)信息：載體大?。?996 bp；四個(gè)片段大?。?76 bp，867 bp，915 bp和647 bp。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

圖10：使用Hieff Clone^TM Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆。

A：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。B：1為載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖。C：菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果，其中1為原始質(zhì)粒對(duì)照電泳，2-5為重組質(zhì)粒，僅檢測(cè)863bp的一個(gè)目的片段，6為假陽性。D：陽性克隆測(cè)序結(jié)果。M：Marker II。（微生物所)

◆ 低濃度載體重組

實(shí)驗(yàn)信息：載體大?。?/span> 4700 bp，目的片段大?。?600 bp。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

圖11：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆。

A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：載體濃度檢測(cè)電泳圖。C：插入片段濃度檢測(cè)電泳圖。D：克隆基因PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體濃度：5 ng/μL，插入片段濃度：25 ng/μL，載體與插入片段摩爾比例為1:2，重組反應(yīng)條件:50℃，20 min。(西南大學(xué))

圖12：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit與不同品牌的同類產(chǎn)品相比，顯示出更高的性價(jià)比

已得到廣大用戶認(rèn)可——使用客戶數(shù)量600+

主要有：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，北京大學(xué)，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，華東理工大學(xué)，上海交通大學(xué)，復(fù)旦大學(xué)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，浙江大學(xué)，中國藥科大學(xué)，武漢大學(xué)，中山大學(xué)，東南大學(xué)，南京林業(yè)大學(xué)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南方醫(yī)科大學(xué)，山西師范大學(xué)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國水稻研究所，中國科學(xué)院水生生物研究所，暨南大學(xué)，中科院健康科學(xué)研究所，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，華東師范大學(xué)，同濟(jì)大學(xué)，中國科學(xué)院微生物研究所，第二軍醫(yī)大學(xué)，上海市東方醫(yī)院，上海植物逆境生物學(xué)研究中心，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，中國科學(xué)院植物研究所，中國科學(xué)院南京土壤研究所，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，中國科學(xué)院生物物理研究所，中國科學(xué)院南海海洋研究所，中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等單位的課題組。

Q：Hieff Clone^TM克隆的原理是什么？

A：利用末端同源重組的原理。將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。

Q：與傳統(tǒng)克隆相比，Hieff Clone^TM克隆有什么優(yōu)勢(shì)？

A：1）無需考慮酶切位點(diǎn)：不受插入片段酶切位點(diǎn)的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。

2）設(shè)計(jì)簡單：在插入片段的PCR擴(kuò)增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。

3）快速：50℃，20 min即可完成重組反應(yīng)。克隆陽性率可達(dá)95%以上。

4）應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結(jié)合Canace高保真酶，應(yīng)用于定點(diǎn)突變。

Q：同源序列長度對(duì)重組效率的影響？

A：同源序列的長度與克隆數(shù)目有相關(guān)性，一般同源片段選擇在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范圍內(nèi)調(diào)整。并且選擇盡量避免出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

Q：線性化載體和目的片段產(chǎn)物的質(zhì)量會(huì)影響重組反應(yīng)嗎？

A：線性化載體或目的片段品質(zhì)較差時(shí)會(huì)極大影響重組反應(yīng)，建議割膠回收純化產(chǎn)物。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒對(duì)感受態(tài)細(xì)胞有要求嗎？

A：推薦使用轉(zhuǎn)化效率為10⁸ cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），*0（cat NO. 11801ES）等。

Q：線性化載體和目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量和比例？

A：載體使用量應(yīng)大于0.01 pmol，推薦使用量0.03 pmol；克隆載體與目的片段摩爾比應(yīng)在2:1-1:5范圍內(nèi)，zui適為1:2-1:3，超過范圍可能會(huì)影響克隆效率。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒適用實(shí)驗(yàn)有哪些？

A：本試劑盒適用于絕大多數(shù)基于常規(guī)“酶切-連接”方法的克隆實(shí)驗(yàn)，并且特別適用于其它常規(guī)方法難以快速實(shí)現(xiàn)的基因多點(diǎn)突變、全基因合成等。

Q：多片段一步法快速定向克隆試劑盒可以用于單片段的克隆嗎？

A：多片段一步法克隆試劑盒可以用于單片段的克隆。但是，單片段克隆試劑盒不建議用于多片段的克隆，重組效率可能會(huì)受到影響。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒反應(yīng)溫度是50℃，是否可以在37℃進(jìn)行反應(yīng)？

A：一般情況下建議在50℃進(jìn)行反應(yīng)。50℃有利于消除DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)是Hieff Clone^TM重組酶的zui適反應(yīng)溫度。37℃反應(yīng)條件也可以進(jìn)行重組反應(yīng)，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行優(yōu)化。

1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（中科院植物生理生態(tài)研究所，王二濤組，IF37.205）

[2]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16.（中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，陳玲玲組，IF30.41）

[3]. Zhu T, Zhao Y, Wu Y, et al. The Staphylococcus epidermidis gdpS regulates biofilm formation independently of its protein-coding function[J]. Microb Pathog, 2017,105: 264–271.（IF2.0）

[4]. Li N, Hong T, Li R, et al. Cherry Valley Ducks Mitochondrial Antiviral-Signaling Protein-Mediated Signaling Pathway and Antiviral Activity Research[J]. Front Immunol, 2016,7:377.（IF6.4）

[5].Ma, Y., et al., miR-1908 Overexpression Inhibits Proliferation, Changing Akt Activity and p53 Expression in Hypoxic NSCLC Cells[J]. Oncol Res, 2016. 24(1): p. 9-15.（IF1.74）

[6].Yan, X., et al., The New Synthetic H2S-Releasing SDSS Protects MC3T3-E1 Osteoblasts against H2O2-Induced Apoptosis by Suppressing Oxidative Stress, Inhibiting MAPKs, and Activating the PI3K/Akt Pathway[J]. Front Pharmacol, 2017. 8: p. 07.（IF4.4）

[7].Lu, J., et al., Tiron Inhibits UVB-Induced AP-1 Binding Sites Transcriptional Activation on MMP-1 and MMP-3 Promoters by MAPK Signaling Pathway in Human Dermal Fibroblasts[J]. PLoS One, 2016. 11(8): p. e0159998.（IF2.8）

[8].Wu, R., et al., Direct regulation of the natural competence regulator gene tfoX by cyclic AMP (cAMP) and cAMP receptor protein (CRP) in Vibrios[J]. Sci Rep, 2015. 5: p. 14921.（IF4.25）

[9].He, D.X., et al., A methylation-based regulatory network for microRNA 320a in chemoresistant breast cancer[J]. Mol Pharmacol, 2014. 86(5): p. 536-47.（IF3.92）

[10].Liang, W., et al., Anti-Restriction Protein, KlcAHS, Promotes Dissemination of Carbapenem Resistance[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2017. 7: p. 150.（IF4.3）

[11].Wang, X., et al., Improved PKS gene expression with strong endogenous promoter resulted in geldanamycin yield increase[J]. Biotechnol J, 2017.（IF2.599）

[12]. Li X, Liu C X, Xue W, et al. Coordinated circRNA biogenesis and function with NF90/NF110 in viral infection[J]. Molecular Cell, 2017. (IF 14.7)

[13].Du L, Dong S, Zhang X, et al. Selective oxidation of aliphatic C–H bonds in alkylphenols by a chemomimetic biocatalytic system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017: 201702317.（IF9.661）

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